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研究目的:1、探讨谷氨酸兴奋毒性损伤对PPARγ表达的影响及其可能的调节机制;2、通过谷氨酸损伤后PPARγ磷酸化修饰的变化,探讨谷氨酸损伤后PPARγ的活性改变及其可能机制。3、观察PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)和MAPK/ERK1/2抑制剂U0126对谷氨酸兴奋毒性损伤的影响,进一步探讨激活PPARγ或保护其活性对谷氨酸兴奋毒性损伤的保护作用。实验方法:以成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠作为实验动物,进行试验。1、SD大鼠随机分为正常组、对照组、谷氨酸组、NMDA组,其中正常组为正常大鼠不予以任何处理,对照组为予以相同体积的安慰剂皮层注射,谷氨酸组及NMDA组予以不同浓度及不同时间处理,其中不同浓度处理组分别予以浓度为50、100、200 mmol/L的谷氨酸或NMDA各1μL皮层注射;不同时间处理组为注射200mmol/L谷氨酸或NMDA分别作用3、6、12、24h后处死。(1)Western blot法检测谷氨酸或NMDA损伤后各组炎症、凋亡相关蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3的表达变化。(2)免疫荧光染色法进行炎症、凋亡相关蛋白染色,观察损伤后COX-2、iNOS、cleaved caspase-3信号强度的变化和细胞定位。(3)通过HE、TTC染色检测谷氨酸或NMDA损伤后的组织学改变。2、SD大鼠随机分为对照组、MK-801单独处理组、谷氨酸组、MK-801处理组,其中对照组为予以相同体积的安慰剂(生理盐水)皮层注射,MK-801单独处理组只给予0.15mg/kg MK-801腹腔注射,谷氨酸组为200 mmol/L谷氨酸1μL皮层注射,MK-801处理组为在谷氨酸处理的基础上,提前30min予以0.375、0.75、0.15mg/kg MK-801腹腔注射,动物24h后处死。(1)Western blot法检测MK-801对谷氨酸引起的炎症、凋亡相关蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3表达变化。(2)HE染色法检测MK-801对谷氨酸损伤后组织学改变的影响。3、SD大鼠随机分为正常组、对照组、谷氨酸或NMDA组,处理方式同前。(1)Western blot法检测谷氨酸损伤对PPARγ、pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表达的影响。(2)免疫荧光染色法进行PPARγ与NeuN双染,观察谷氨酸损伤后PPARγ表达变化及细胞定位。4、SD大鼠随机分为对照组、干预剂单独处理组、谷氨酸或NMDA组、干预剂组。干预剂分别为MK-801腹腔注射、GSH鼠尾静脉注射、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO皮层微量注射。对照组、谷氨酸或NMDA组处理同前,干预剂单独处理组为只给予干预剂处理,干预剂组为在谷氨酸或NMDA(200mmol/L)处理的基础上,提前30min予以各干预剂处理。Western blot法检测各组PPARγ表达。5、SD大鼠随机分为对照组、U0126单独处理组、谷氨酸或NMDA组、U0126组。对照组、谷氨酸或NMDA组,处理方式同前。U0126单独处理组为只给与U0126处理。U0126组为在谷氨酸或NMDA(200 mmol/L)的基础上,提前30min予以U0126处理。Western blot法检测ERK1/2激活抑制剂U0126对谷氨酸或NMDA引起的pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表达的影响。6、SD大鼠随机分为正常组、对照组、保护剂单独处理组、NMDA组、保护剂组。保护剂为Ros、Pio腹腔注射或U0126皮层注射。其中正常组、对照组、NMDA组处理同前,保护剂单独处理组为只给予保护剂处理,保护剂组为在NMDA(200 mmol/L)的基础上,提前30min予以保护剂处理。(1)HE、TTC染色法评价各保护剂对NMDA损伤的保护作用。(2)Western blot法检测各组炎症、凋亡相关蛋白表达变化。(3)免疫荧光染色法进行炎症、凋亡相关蛋白与NeuN双染,观察保护剂对谷氨酸损伤后的保护作用及细胞定位。实验结果:1、谷氨酸兴奋毒性损伤模型评价:(1)Western blot法检测显示,谷氨酸或NMDA引起COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表达增加,而MK-801可抑制谷氨酸引起的上述蛋白表达增加(P<0.05,差异具有统计学意义)。(2)免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,谷氨酸或NMDA组COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白信号强度增强(P<0.05)。(3)HE染色显示谷氨酸或NMDA处理引起的皮层损伤,且这种损伤可被MK-801抑制,提示谷氨酸兴奋毒性损伤主要通过NMDA受体介导。2、谷氨酸对PPARγ的调节作用:(1)谷氨酸处理:1)Western blot法检测显示,与对照组相比,PPARγ表达呈时间及剂量依赖性增加(P<0.05,差异具有统计学意义)。2)免疫荧光染色法显示,与对照组相比,PPARγ蛋白信号强度增强,且大部分可与NeuN信号叠加,提示主要表达于神经元细胞中。(2)NMDA处理:Western blot法检测显示,与对照组相比,PPARγ表达呈时间及剂量依赖性增加(P<0.05,差异具有统计学意义),与谷氨酸作用一致。(3)MK-801处理:Western blot法检测显示,MK-801可明显抑制谷氨酸引起的PPARγ表达增加,作用具有剂量依赖性,提示谷氨酸对PPARγ的作用主要通过NMDA受体介导。(4)其它处理:Western blot法检测显示,与NMDA组比较,随着GSH、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO提前给予,NMDA引起的PPARγ表达增加被抑制(P<0.05,差异具有统计学意义),提示谷氨酸对PPARγ的作用与氧化应激、钙离子-calpain-caspase 3信号途径有关。3、谷氨酸对PPARγ活性的调节作用:(1)p-PPARγ表达:Western blot法检测显示,NMDA处理3-24h引起p-PPARγ表达呈时间依赖性增加。(2)PPARγ表达:Western blot法检测显示,NMDA处理3、6 h PPARγ无明显改变,12、24h PPARγ表达明显增加。(3)p-PPARγ/PPARγ比值:NMDA处理引起比值呈双相性改变,3-6h增加,12-24h下降(即恢复),提示NMDA通过诱导PPARγ磷酸化可引起PPARγ活性一过性抑制。(2)p-ERK1/2表达:Western blot法检测显示,NMDA引起p-ERK1/2表达增加,作用呈时间及剂量依赖性(P<0.05,差异具有统计学意义),总ERK1/2无变化。(3 ERK1/2抑制剂U0126的作用:U0126可抑制NMDA引起p-ERK1/2、p-PPARγ表达增加,提示NMDA可通过激活ERK1/2引起PPARγ磷酸化。4、保护剂Ros、Pio、U0126对谷氨酸兴奋毒性保护作用:(1)HE染色及TTC染色可见,与NMDA组相比,保护剂组损伤体积较NMDA组损伤体积明显减小。(2)Western blot法检测显示,保护剂Ros、Pio、U0126可明显抑制NMDA引起的COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表达增加(P<0.05,差异具有统计学意义)。提示激活PPARγ或保护其活性对谷氨酸兴奋毒性损伤具有保护作用。实验结论:1、谷氨酸主要通过NMDA受体产生兴奋毒性损伤作用2、谷氨酸损伤引起神经元PPARγ的表达增加,该作用可能为NMDA受体依赖的、钙离子-calpain-caspase-3介导的、与氧化应激有关的一种神经元自我保护性反应。3、谷氨酸兴奋毒性损伤早期通过增加PPARγ磷酸化修饰而引起一过性PPARγ活性抑制,该作用可能与谷氨酸激活MAPK/ERK1/2通路有关。4、PPARγ激动剂(Ros、Pio)及ERK1/2激活抑制剂(U0126)对谷氨酸兴奋毒性具有保护作用,其作用机制可能通过激活PPARγ或保护其活性,产生直接或间接的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有关。