研究背景及目的大肠埃希菌（Escherichia coli,E coli）是临床常见致病菌,分离率在G-菌中居首位。E coli的耐药问题一直是临床治疗所面对的重要挑战,尤其当其形成细菌生物膜（Bacteria Biofilm）以后,耐药能力大幅度上升,也为耐药基因的传递和播散创造了条件。细菌生物膜是细菌粘附多种物质表面,通过释放多糖和蛋白质形成含水基质包绕菌体而构成的具有立体结构的细胞群落。临床上80%的感染都和生物膜相关。由于生物膜的物理屏障和生物膜内细菌较低的生长速度和代谢水平,使细菌可以逃避抗菌药物和宿主免疫系统的攻击。在条件适宜时,生物膜内的细菌可以解离,导致新的感染,这一过程使感染趋于慢性化且难于控制。因此,寻求新的以生物膜为对象的抗感染治疗靶点是目前亟待解决的问题。新近的研究显示,多种抗菌药物在亚-MIC浓度可影响细菌某些生物学行为,包括毒力、运动力及生物膜形成等,这种调节作用可能影响药物治疗结果。由于在抗感染治疗的体内过程中,抗菌药物处于亚-MIC的阶段本就不可避免,加之临床高MIC值耐药菌的大量出现,更使得抗菌药物处于亚-MIC的时间更长。因此,研究亚-MIC抗菌药物对生物膜的调控作用对于阐明细菌耐药机制和寻找有效的耐药菌控制手段都具有重要理论指导作用。亚-MIC抗菌药物对细菌生物膜形成的影响机制尚不明确,群体感应系统（Quorum Sensing,QS）对抗菌药物的响应可能是主要机制之一。几乎所有细菌体内都至少存在一种群体感应系统,可被特异性的自体诱导信号分子活化。信号分子表达的调控是群体感应系统活性调节的中心环节,亦可能成为药物干扰QS的主要作用靶点。亚-MIC抗菌药物通过抑制细菌QS信号分子的合成而减少其毒力因子释放和生物膜形成的作用已在部分药物和菌种得到证实,并且群体感应系统抑制不直接杀灭细菌,不会产生选择性压力,也不会诱导耐药。在已有药物中筛选对E coli生物膜具有调控作用的药物并深入探讨其发生机制,对于研究细菌耐药机制和制定新的、更为科学有效的治疗方案具有积极的意义。本研究首先对我院住院患者标本中分离得到的E coli菌株生物膜形成能力和耐药进行分析,随后观察常用抗菌药物在亚-MIC对ATCC700926和DH5α生物膜形成能力的影响,并以实验中亚-MIC头孢他啶（ceftazidime,CAZ）表现出的生物膜抑制现象为线索,观察亚-MIC CAZ等四种三代头孢菌素对标准菌株和临床分离菌株生物膜形成的影响。选取代表性菌株从细菌耐药表型、药物的稳定性及生物膜形成主要调控基因的变化入手,分析其可能机制发现lux S在药物影响生物膜的过程中转录发生变化,进而通过as-ODN和基因敲除菌株等方法深入研究亚MIC CAZ和CFP调节大肠埃希菌生物膜形成的机制。研究方法第一部分大肠埃希菌临床分离株的耐药表型及生物膜形成1.1药敏试验参照美国国家临床实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）发布的《抗菌药物敏感性试验执行标准》（2010版）,以标准琼脂平板倍比稀释法测定抗菌药物对E coli菌株的MICs。1.2 E coli生物膜形成的测定1.2.1 E coli生物膜形成半定量检测:采用96孔板结晶紫染色法,酶标仪测定590nm处光密度。1.2.2 E coli生物膜形成能力影响因素分析以E coli标准菌株ATCC700926为研究对象,在2种培养基中（LB培养基和M9培养基）、加入3个浓度的初始密度的细菌（106 CFU/L、107 CFU/L、108 CFU/L）、在4个培养时程（6h、12h、18h、24h）观察生物膜形成。采用公式BF=（AB-CW）?G评价生物膜形成能力（公式中AB为细菌生物膜测定值,CW为染色本底,G为细菌光密度测定值,以OD600nm表示）。1.2.3 E coli临床分离株生物膜形成能力评价收集E coli临床分离株63株进行细菌生物膜形成能力筛选。以实验1.2.2的获得的最优条件和评价方法进行。1.3 E coli生物膜形成能力与产ESBLs的相关性研究采用双纸片协同试验检测E coli ESBLs,分析产/不产ESBLs E coli菌株生物膜形成能力有无差异。1.4 E coli生物膜形成能力与携带ESBLs基因的相关性研究PCR检测E coli基因组DNA携带的ESBLs相关基因,分析携带/不携带ESBLs基因的E coli菌株生物膜形成能力有无差异。1.5 E coli多位点序列分型以63株临床分离E coli菌株为研究对象,采用多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）对菌株进行分型。结果与MLST database进行比对,获得MLST数据。第二部分亚-MIC头孢他啶等抗菌药物对大肠埃希菌生物膜形成的影响2.1亚-MICs抗菌药物对E coli生物膜形成的影响以E coli标准菌株ATCC700926和DH5α为研究对象,评价1/4 MIC 9种抗菌药物（CXM、CAZ、FEP、PIP、AMI、TOB、CIP、ERY、TE）对E coli生物膜形成的影响。按实验药物分组,设置阴性对照组（不加药）。采用96孔板结晶紫染色法,培养24h检测。以亚MIC的CAZ抑制生物膜形成为线索,观察亚-MIC CAZ等4种三代头孢菌对E coli临床株和实验室菌株生物膜形成的影响,方法同上。2.2亚-MIC CAZ和CFP影响E coli生物膜形成的剂量-效应和时间-效应分析以E46（CAZ作用最显著）、E49（CFP作用最显著）、E42（既可被CAZ抑制,又可被CFP诱导）及ATCC700926（可被CAZ抑制的实验室菌株）为研究对象,剂量-效应分析设置空白对照及1/32-1/2MIC 5个剂量组,时间-效应分析设置6h、12h、18h和24h 4个时间点。第三部分亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮影响大肠埃希菌生物膜形成的机制初探3.1 CAZ和CFP对E coli生物膜的影响与细菌耐药和耐药基因的相关性3.1.1 CAZ和CFP对E coli生物膜的影响与细菌耐药表型的相关性根据菌株对CAZ或CFP的耐药表型,以及CAZ和CFP对生物膜的影响,分析CAZ和CFP对耐药表型不同的E coli菌株生物膜形成的影响有无差异。3.1.2 CAZ和CFP对E coli生物膜的影响与菌株携带ESBLs基因的相关性以ATCC700926、E46、E49、E42为研究对象,观察CAZ和CFP对E coli菌株生物膜形成的影响与菌株是否携带ESBLs基因有无相关性。3.2 CAZ和CFP影响生物膜形成作用过程中的稳定性研究3.2.1 CAZ和CFP浓度检测方法的建立采用高效液相色谱法（HPLC）检测CAZ和CFP浓度,绘制标准曲线。3.2.2药物样品的制备和检测将过夜培养的菌液稀释至0.5Mc Farland单位（约108CFU/m L）,加入1/4MIC CAZ或CFP,设空白对照（不加菌液）;分别于0h,2h,4h和6h取样检测。记录峰面积,计算CAZ或CFP的浓度。3.3亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜形成相关基因表达的影响（RT-PCR）按照TRNzol总RNA提取试剂说明书提取RNA,参考genebank大肠杆菌MG1655基因全序列（NC₀00913）,采用Genne Tool软件针对QS相关基因pfs、lux S、tna A及生物膜相关基因ari R、hha和tomb序列设计引物。参照试剂盒说明书进行RT-PCR。第四部分亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮通过lux S/AI-2群体感应系统调节大肠埃希菌生物膜形成的机制研究4.1亚-MIC CAZ、CFP对E coli生长的影响以分光光度法检测细菌生长数量,分别于0,4,8,12,16,20和24h时间点取样100μl,检测OD600nm,绘制生长曲线。每个菌株均分为对照组、CAZ组和CFP组3组。4.2荧光定量PCR检测lux S m RNA的变化按照TRNzol总RNA提取试剂说明书提取RNA。参考genebank大肠杆菌MG1655基因全序列（NC₀00913）,采用Genne Tool软件设计引物。采用SYBR green法进行荧光定量PCR,参照试剂盒说明书进行。4.3亚-MIC CAZ和CFP对E coli AI-2合成的影响以哈氏弧菌BB170的稀释菌液为报告菌株,以ATCC700926上清倍比稀释液为样品,采用生物发光法观察AI-2的最佳检测条件。观察亚-MIC CAZ和CFP对E coli AI-2合成的影响,每个菌株分为3组:对照组、CAZ组和CFP组,每组设3个重复。4.4 1/4MIC CAZ和CFP对E coli AI-2调节生物膜形成的下游基因的影响（RT-PCR）以ATCC700926、E46、E49和E42为研究对象,方法同3.3。4.5针对lux S的反义寡核苷酸（as-ODNs）对CAZ和CFP调节生物膜形成作用的影响4.5.1 As-ODNs对E coli lux S的干扰作用在https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress根据E coli ATCC700926 lux S序列设计并合成4条as-ODNs,转染E coli,以AI-2的合成量评价干扰效果。设置空白对照（BC,感受态E coli细胞以Ca Cl2溶液替代）和阴性对照（TC,as-ODNs以溶剂dd H2O替代）。选择干扰效果最好的用于后续研究。4.5.2针对lux S的反义寡核苷酸（as-ODNs）对CAZ和CFP调控E coli生物膜形成作用的影响以干扰效果最强的as-ODN转染感受态E coli细胞,与未转染细胞进行比较,观察针对lux S的as-ODN干扰lux S转录后,亚-MIC CAZ和CFP对细菌生物膜形成的影响。4.6 1/4 MIC CAZ对ATCC700926△lux S生物膜形成的影响亚MIC CAZ可抑制ATCC700926生物膜形成,以ATCC700926的lux S敲除株为研究对象,观察1/4 MIC CAZ对ATCC700926△lux S生物膜形成的影响。主要研究结果第一部分大肠埃希菌临床分离株的耐药表型及生物膜形成1.1 E coli临床分离株对抗菌药物的耐药表型分析临床分离E coli对青霉素类药物、氟喹诺酮类、复方新诺明耐药率较高,均在50%以上,而对青霉素类与β内酰胺酶抑制剂的复合制剂敏感率较高。对二代头孢菌素头孢呋辛耐药率较高,而对三代头孢菌素CAZ、四代头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药物则表现出较好的敏感性。1.2 E coli临床分离株的生物膜形成能力1.2.1 E coli生物膜形成能力影响因素分析E coli在LB培养基中,初始细菌浓度108/L培养24h生物膜形成能力最强。1.2.2 E coli临床分离株的生物膜形成能力绝大部分E coli临床株可形成生物膜,其中81.0%（51/63）具有中等以上生物膜形成能力,14.3%（9/63）的菌株生物膜形成能力较弱,仅有3株菌不形成生物膜。1.3 E coli临床分离株的生物膜形成能力与产ESBLs的相关性研究63株E coli临床分离株中20株为ESBLs阳性菌株,阳性率为31.7%。卡方检验结果显示产/不产ESBLs E coli菌株生物膜形成能力无显著差异,提示E coli临床分离株的生物膜形成能力与是否产ESBLs无相关性。1.4 E coli临床分离株生物膜形成能力与携带ESBLs基因的相关性研究20株产ESBLs的E coli中95%（19株）携带CTX-M基因,而TEM、OXA和SHV基因分别见于80%（16株）、20%（4株）和20%（4株）的E coli分离株。进行卡方检验结果显示携带/不携带ESBLs基因的E coli菌株生物膜形成能力无显著差异,提示E coli临床分离株生物膜形成能力与携带ESBLs基因无相关性。1.5 E coli临床分离株多位点序列分型扩增7个等位基因,产物测序、比对结果显示63株临床分离E Coli有31个基因型,其中ST131和ST167分别有10株和7株,是最常见的基因型。ST10和ST38型分别有4株。第二部分亚-MIC头孢他啶等抗菌药物对大肠埃希菌生物膜形成的影响2.1亚-MICs 9种抗菌药物对E Coli ATCC700926和DH5α生物膜形成的影响1/4MIC CAZ可抑制ATCC700926生物膜形成,其余抗菌药物对ATCC700926和DH5α生物膜形成无影响。2.2亚-MICs CAZ等抗菌药物对E Coli生物膜形成的影响为了进一步评价CAZ的生物膜抑制作用在E coli是否具有普遍性,并明确此作用为CAZ所特有,还是三代头孢菌素的共性,选取另外3种常用三代头孢菌素,并纳入E coli临床株进行对照研究。结果显示,1/4 MIC CAZ可抑制包括ATCC700926在内的12.7%（8/63）E coli菌株生物膜形成;1/4 MIC CFP可诱导33.3%（21/63）E coli生物膜形成。头孢曲松（Ceftriaxome,CTR）和头孢噻肟（Cefotaxime,CTX）对E coli生物膜形成未表现出明显的抑制或者诱导作用。E coli临床分离株E42的生物膜形成在被1/4 MIC CAZ抑制的同时,可被1/4 MIC CFP诱导。选取E46（CAZ抑制作用最显著）、E49（CFP诱导作用最显著）、E42（既可被CAZ抑制,又可被CFP诱导）及ATCC700926（可被CAZ抑制的实验室菌株）进行后续研究。2.4亚-MIC CAZ和CFP影响E coli生物膜形成的剂量-效应和时间-效应分析剂量-效应研究显示,CAZ对ATCC700926,E42和E46生物膜形成的抑制作用呈现了显著的剂量依赖性;CFP可在1/16 MIC-1/2 MIC范围内剂量依赖性诱导E42生物膜形成,CFP对E49生物膜形成的诱导作用无剂量依赖性,在1/4MIC作用最强。时间-效应分析结果显示亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜的影响均在18-24h达到最大效应。第三部分亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮影响大肠埃希菌生物膜形成的机制初探3.1 CAZ和CFP调控E coli生物膜形成的作用与细菌耐药和耐药基因的相关性3.1.1 CAZ和CFP调控E coli生物膜形成的作用与细菌耐药表型的相关性经卡方检验,CAZ和CFP对细菌生物膜形成的调节作用在耐药表型不同的菌株之间无显著差异,提示药物影响生物膜形成的作用与细菌耐药表型无相关性。3.1.2 CAZ和CFP调控E coli生物膜形成的作用与细菌携带ESBLs基因的相关性可被CAZ抑制的ATCC700926和E46,携带ESBLs基因不同;携带相同耐药基因E49和E42,其生物膜形成受药物的影响却不相同。提示CAZ与CFP对E coli生物膜形成的调节,不受菌株是否携带ESBLs耐药基因影响。3.2 CAZ和CFP影响生物膜形成过程中的稳定性研究3.2.1 HPLC法检测CAZ和CFP浓度的方法的建立3.2.1.1标准曲线CAZ在LB溶液中的回归方程为:Y=24.92X+9.84（r2=0.9998）,CFP在LB溶液中的回归方程为:Y=24.92X+9.84（r2=0.9998）,CAZ和CFP浓度在0.5-80μg/m L范围内与峰面积呈现良好的线性关系。3.2.2 CAZ和CFP影响生物膜形成过程中的稳定性研究1/4MIC（64μg/ml）CAZ加入含E46菌液的培养基中,药物即开始发生降解,随着培养时间延长,细菌浓度增加,CAZ降解速度加快,6h后药物浓度仅为初始浓度的39.3%。1/4 MIC CFP（64μg/ml）在含E11菌液的培养基中亦快速降解,2h即完全降解。3.3亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜形成主要调节基因的影响3.3.1亚-MIC CAZ和CFP对E coli QS相关基因转录的影响1/4 MIC CAZ和CFP与细菌共孵3h后,lux S/AI-2 QS系统信号分子合成酶Lux S的基因转录水平与生物膜变化一致,而另外两个QS相关基因pfs和tna A未发生显著变化,结果提示lux S/AI-2群体感应系统可能在亚MIC CAZ和CFP调控E coli生物膜形成的过程中发挥重要作用。3.3.2亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜相关基因转录的影响1/4 MIC CAZ和CFP与细菌共孵3h后,hha、tomb和ari R转录未发生显著变化,提示上述生物膜相关基因未参与CAZ和CFP对生物膜形成的影响。第四部分亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮通过lux S/AI-2群体感应系统调节大肠埃希菌生物膜形成的机制研究4.1亚-MIC CAZ和CFP对E coli lux S/AI-2系统的影响4.1.1亚-MIC CAZ和CFP对E coli生长的影响1/4 MIC CAZ和CFP均不影响4株E coli细菌生长,提示亚-MIC CAZ和CFP不是通过抑制或诱导细菌生长对lux S/AI-2系统调节的。4.1.2亚-MIC CAZ和CFP对E coli lux S转录、AI-2合成及下游信号分子转录的影响同步检测1/4 MIC CAZ和CFP对E coli lux S的变化、AI-2合成的变化及下游信号分子mqs R,qse BC和mcb R转录,结果显示1/4MIC CAZ可显著抑制ATCC700926、E46和E42 lux S转录、AI-2合成和下游信号分子mqs R,qse BC和mcb R的转录。与之相反,1/4MIC CFP可显著诱导E49和E42 lux S转录、AI-2合成和下游信号分子mqs R,qse BC和mcb R的转录,这与CAZ和CFP对E coli生物膜的影响一致。4.2针对lux S的反义寡核苷酸（as-ODNs）对CAZ和CFP调节生物膜形成作用的影响针对lux S的反义寡核苷酸as-ODN4可降低4个菌株AI-2浓度达50%以上,提示其具有较好的lux S干扰效果。以as-ODN4转染E coli细胞,细菌生物膜形成能力显著下降,且转染后1/4 MIC CAZ和CFP不再引起细菌生物膜形成的改变,进一步证实亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜的调节作用是基于lux S/AI-2系统的调控实现的。4.3亚-MIC CAZ对ATCC700926△lux S生物膜形成的影响亚-MIC CAZ对ATCC700926的生物膜抑制作用在lux S敲除株ATCC700926△lux S中消失,进一步证明lux S/AI-2系统在亚-MIC CAZ对生物膜的抑制中发挥重要作用。前期研究中亚-MIC CAZ对不能合成AI-2的E coli标准菌株DH5α生物膜形成无抑制作用（结果2.1和2.2）,为上述观点提供了佐证。ATCC700926生物膜形成可被亚-MIC CAZ抑制,但不受CFP诱导。课题组拟在临床株（E42和E49）中敲除lux S确证其在CFP诱导中的作用,但由于其基因背景复杂且耐药,并未敲除成功。结论1.亚-MIC CAZ和CFP可影响E coli生物膜的形成。2.E coli临床分离株E42的生物膜形成在被亚-MIC CAZ抑制的同时,可被亚-MIC CAZ诱导。3.亚-MIC CAZ和CFP对lux S/AI-2系统活性的影响不是通过抑制或诱导细菌生长实现的,其对E coli生物膜的影响与其抗菌作用机制不同。4.亚-MIC CAZ和CFP主要通过影响lux S的转录调控E coli生物膜形成,而不影响pfs、tna A、hha、tomb和ari R的转录。5.亚-MIC CAZ和CFP对E coli生物膜的调控作用是基于群体感应系统lux S/AI-2活性变化实现的。