【摘 要】
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鳜（Siniperca chuatsi）和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）是两种重要的淡水养殖鱼类,具有优异的肉质和极高的经济价值,在我国具有比较大的养殖规模。近年来,随着集约化养殖的迅速发展,传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）和鲶爱德华氏菌导致的传染病不断爆发,给我国的鳜和黄颡鱼养殖业造成了严重的经济损失。为了有效地控制这两种传染病的暴发和传播,快速、灵敏地检测ISKNV和
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鳜（Siniperca chuatsi）和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）是两种重要的淡水养殖鱼类,具有优异的肉质和极高的经济价值,在我国具有比较大的养殖规模。近年来,随着集约化养殖的迅速发展,传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）和鲶爱德华氏菌导致的传染病不断爆发,给我国的鳜和黄颡鱼养殖业造成了严重的经济损失。为了有效地控制这两种传染病的暴发和传播,快速、灵敏地检测ISKNV和鲶爱德华氏菌至关重要。因此,我们希望建立一种能够在现场检测ISKNV和鲶爱德华氏菌的快速检测方法。在本研究中,我们将RPA技术应用于ISKNV和鲶爱德华氏菌的检测,建立了ISKNV和鲶爱德华氏菌的RPA快速检测方法,从而实现对两种病原的早期诊断,有效地控制这两种传染病的暴发和传播。本研究分为ISKNV RPA快速检测方法的建立和鲶爱德华氏菌RPA快速检测方法的建立两个部分。1、ISKNV RPA快速检测方法的建立。我们针对ISKNV的MCP和ORF007基因,设计了6组RPA引物,其中引物MCPF181/MCPR182和007F197/007R198被选为最适引物,用于后续的ISKNV RPA检测。然后我们对建立的ISKNV RPA和RPA-LFD检测方法的反应条件进行优化,发现38°C为ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最适反应温度,30 min为ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最适反应时间,并将该条件用于后续的ISKNV RPA和RPA-LFD检测试验。我们以不同病原的核酸样品作为模板,用ISKNV RPA和RPA-LFD方法进行检测,发现只有ISKNV的DNA检测为阳性。我们以梯度稀释的质粒作为模板,用ISKNV RPA和RPA-LFD方法进行检测,发现ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最低检测限都为10~2 copies/μl,比PCR方法的最低检测限低10倍。我们以鳜的临床样品DNA作为模板,用RPA、RPA-LFD和PCR方法进行检测,发现ISKNV RPA和RPA-LFD方法对临床样品检测出的阳性率与PCR方法相同。总之,我们建立的ISKNV RPA和RPA-LFD检测方法只需在38°C条件下反应30 min就可以完成检测,而且具有高度的特异性,灵敏性也比PCR方法高10倍,还可以达到和PCR一样的临床样品检测效果。2、鲶爱德华氏菌RPA快速检测方法的建立。我们针对鲶爱德华氏菌的serC基因,设计了9种RPA引物组合,其中引物serCF564/serCR569的扩增效果最好,被选为最适引物,用于后续的鲶爱德华氏菌RPA检测。然后我们对建立的鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD检测方法的反应条件进行优化,发现38°C为鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD方法的最适反应温度,30min为鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD方法的最适反应时间,并将该条件用于后续的鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD检测试验。我们以不同病原的核酸样品作为模板,用鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法进行检测,发现只有鲶爱德华氏菌的DNA检测为阳性。我们以梯度稀释的质粒和基因组DNA作为模板,用鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法进行检测,发现鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法对质粒的最低检出浓度都为10~2 copies/μl,对基因组DNA的最低检出浓度都为1 pg/μl。我们以黄颡鱼的临床样品DNA作为模板,用RPA、RPA-LFD、实时RPA和PCR方法进行检测,发现鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法对临床样品检测出的阳性率与PCR方法相同。总之,我们建立的鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA检测方法只需在38°C条件下反应30 min就可以完成检测,而且灵敏性与q RT-PCR方法相同,比PCR方法高10倍,还具有高度的特异性,在临床样品检测方面,具有和PCR方法一样的实用性。本研究的结果表明,我们针对ISKNV和鲶爱德华氏菌开发的RPA相关检测方法很适用于ISKNV和鲶爱德华氏菌的快速检测,其中ISKNV和鲶爱德华氏菌的RPA-LFD检测方法因为操作简单,不需要复杂的仪器,所以在这两种病原的现场检测中具有很大的应用潜力。
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