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赭曲霉毒素A(OTA)是一种主要由赭曲霉、青霉及黑曲霉菌中的某些菌株产生的次级代谢产物,具有多种毒性,在全球范围内,葡萄及其制品中的OTA污染普遍存在,严重影响人类和动植物的健康。对于控制OTA的方法已经有许多研究,其中生物方法安全环保是目前研究的热点,而认识OTA来源及其产生机制是生物防治污染的基础。随着分子生物学的发展,对于毒素的合成途径和机制的认识正在逐步加深,一些新型的分子生物学方法已经被应用于机制研究中,并通过这些研究成果开发出具有实际应用价值的快速检测和降低毒素产生的方法。而产生OTA的菌株种类繁多,且其分布因地域和气候而异,需要丰富OTA产毒菌的数据库以寻求广谱性且有效的控制产毒的方法,以期降低OTA污染。 本课题在镇江句容的生态葡萄园里筛选到几株产毒菌株,选取了其中产毒量最高的X9-4灰黄青霉为研究对象,进一步研究环境对其生长和产毒的影响,并通过产毒和不产毒条件下蛋白与基因表达差异探究了灰黄青霉中赭曲霉毒素A产生的机制。主要研究结果如下: 1.利用荧光现象初筛和高效液相荧光检测法复筛,并使用液质联用分析鉴定代谢产物,从镇江市句容葡萄园筛选到几株产毒菌,其中一株取样自巨峰葡萄品种腐烂果实上的霉菌X9-4产毒量最高,进行5.8S rDNA-ITS序列测序分析,并结合其形态学特征鉴定该菌株为灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)。 2.对分离到的灰黄青霉X9-4产毒菌进行生长和产毒条件(如温度、培养基、pH值、光照等)的研究。实验结果表明,该菌株灰黄青霉在pH为5的CYA培养基中25 ℃下避光培养两周时毒素含量最高,此条件下生长良好。灰黄青霉X9-4在低温下不生长,在非生长适宜温度环境,极酸或碱性环境,光照等条件下其产毒能力受到抑制。 3.利用蛋白质组学的方法,以灰黄青霉X9-4为研究对象,分别在pH为3(抑制产毒)和5(高产毒)的培养条件下,分析影响其产毒能力的差异蛋白。得到一些影响其产毒能力的相关蛋白,这些蛋白分属于“基础代谢与合成相关蛋白”、“能量供应相关蛋白”、“转运蛋白”、“应激蛋白”、“调控蛋白”等。 4.对不同pH条件下灰黄青霉中相关基因的转录水平进行比较,实验结果发现,在低pH环境中,与其毒素合成相关的一些关键酶的转录水平有所降低,推测低pH环境下能够抑制灰黄青霉中赭曲霉毒素A的产生。