肝移植是治疗原发性肝癌的有效手段，肝移植术后肿瘤复发影响其长期疗效，但目前临床治疗方法效果均不理想，免疫治疗可能成为新的治疗模式。 NK细胞(naturalkiller，NK)是机体天然免疫的核心细胞，对肿瘤细胞具有先天识别作用，在细胞因子的激活下能溶解低水平HLA—I的自体或异体肿瘤细胞，控制肿瘤的生长速度并防止其传播扩散，甚至引起部分转移瘤的消退，延长生存时间。 多数肿瘤细胞经典HLA—I类分子表达下调，非经典HLA—I类分子异常表达，NK细胞的抑制受体CD94/NKG2-A、NKG2-B与非经典HLA—I类分子HLA—E/G结合，抑制了NK细胞对肿瘤细胞的溶解作用，可能是肿瘤细胞逃避NK细胞免疫监视的一个新机制，封闭其抑制性受体CD94/NKG2则可提高NK细胞的抗肿瘤作用。 人类白细胞抗原—E(HLA—E)是功能和作用途径较为明确的主要非经典HLA—I类分子，是免疫细胞表面的抑制性受体CD94/NKG的主要配体。HLA—E将绝大多数HLA—I类源性的引导肽呈递给NK细胞的受体，通过CD94/NKG2受体调控NK细胞的功能，抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。若能有效下调肿瘤HLA—E基因的表达，可抑制其通过CD94/NKG2等受体的抑制信号传递，提高机体NK细胞对肿瘤的杀伤作用，但不会特别影响正常细胞的免疫功能。 RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing)过程，通过siRNA形成RNA诱导沉默复合体(RNA—inducedsilencingcomplex)，识别靶mRNA并使其特异性降解，从而使该基因表达沉默，抑制宿主细胞蛋白质的表达。 由于RNAi主要是发生在细胞质中，因此外源性的siRNA或者shRNA必须穿过细胞膜，在胞质内达到足够浓度才能发挥阻抑效应，而目前的转运介导方式如病毒载体等都存在相应的缺点，临床应用价值不大。 阳离子多聚物聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前常用的纳米基因载体，具有相对较高的转染效率。但PEI具有一定的细胞毒性，原因在于大分子量PEI在细胞内聚集而产生高密度的阳离子电荷。聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)修饰可屏蔽PEI密度过高的正电荷，从而降低其细胞毒性。但PEG修饰后的PEI与核酸形成的复合物颗粒较大，不利于细胞摄取，对PEG—PEI进行靶向性修饰可提高对特定细胞的转染效率。在纳米基因载体的表面偶联靶细胞的配体或抗体，通过靶向性分子与细胞表面特异性受体结合，可实现基因治疗的主动靶向性。肝细胞表面拥有丰富的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor，ASGR)，能与有半乳糖末端的去唾液酸糖蛋白结合并内化，因此对纳米载体进行特异性半乳糖改性修饰，可使其具有肝细胞靶向性。靶向性基因载体可有效提高基因传递的特异性，降低治疗副作用。 利用肝细胞靶向性纳米基因载体介导siRNA质粒转染肝癌细胞，可有效下调肝癌细胞HLA—E的表达，提高机体NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，增强机体的免疫细胞监视功能，而不干扰机体免疫系统功能。 本研究通过合成肝细胞靶向性纳米基因载体半乳糖—聚乙二醇—聚乙烯亚胺(galactosylatedpoly(ethyleneglycol)—graft—polyethylenimine，Gal—PEG—PEI)并考察其基本理化性能，并利用其为载体介导psiRNA转染肝癌细胞系HepG2，观察细胞转染效率及相关影响因素，并对其体外干扰HepG2细胞HLA—E基因表达的效果及机制进行分析，为肝癌肝移植术后复发的预防和治疗提供新的途径。 方法: 1.两步法合成Gal—PEG—PEI，提取质粒，按不同的N/P(Gal—PEG—PEI中氨基与psiRNA磷酸基比例)合成Gal—PEG—PEI/psiRNA纳米粒。用1H—NMR、激光衍射纳米粒度分析仪、透射电镜、凝胶阻滞实验、EB结合残余DNA实验、DNaseⅠ酶消化、细胞毒性实验等方法检测其理化性质。 2.Gal—PEG—PEI介导psiRNA转染HepG2细胞，24h后，用倒置荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的表达情况，转染48h后，用流式细胞仪检测细胞转染效率；测定半乳糖竞争拮抗效果及血清对转染效率的影响。转染人肝癌细胞系BEL—7402、人肝癌细胞系SSMC—7721、人胎肝细胞系L—02及胚肾细胞系AD293细胞并测定其转染效率。 3.分别用裸psiRNA、PEG—PEI/psiRNA、Gal—PEG—PEI/NC—psiRNA、Gal—PEG—PEI/psiRNA、Lipofectamine2000/psiRNA转染HepG2，RealtimeRT—PCR检测细胞的HLA—EmRNA表达水平，Westernblot检测HLA—E蛋白水平。 结果: 1.Gal—PEG—PEI的1H—NMR图谱分析表明Gal是PEI的氨基的0.2mol％。 2.随N/P的不断增大，Gal—PEG—PEI/psiRNA纳米复合物的粒径逐渐减小，分布范围变窄，最小粒径为81.1±1.0nm。Zeta电位则随着N/P的增大而逐渐上升。 3.透射电镜观察，N/P=8时，Gal—PEG—PEI/psiRNA纳米复合物平均粒径为62.93±27.16nm。 4.EB结合残余psiRNA实验表明Gal—PEG—PEI对psiRNA的包覆效率高于PEG—PEI和PEI。 5.DNaseⅠ酶消化实验表明纳米复合体对psiRNA有一定的保护作用，而裸psiRNA在相同条件下则被完全降解。 6.Gal—PEG—PEI的细胞毒性和PEG—PEI无明显差别(P>0.05)，而明显低于PEI(P<0.01)。 7.Gal—PEG—PEI组、PEG—PEI组转染HepG2的效率随N/P的增加而增强，在N/P=8时，Gal—PEG—PEI组取得最高转染效率(37.34±2.45)％，在N/P=7时，PEG—PEI组取得最高转染效率(12.45±0.89)％，之后随N/P的增加而转染效率逐渐减弱；Gal—PEG—PEI组的最高转染效率显著高于PEG—PEI组、Lipofectamine2000组(29.09±1.78)和裸psiRNA组(0.52±0.23)％(P＜0.01)；加入半乳糖后，Gal—PEG—PEI组的转染效率为(3.6±1.22)％，显著低于对照组(P＜0.01)。PEG—PEI组、Lipofectamine2000组的转染效率分别为(12.15±0.53)％、(26.4±5.12)％，与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)；Gal—PEG—PEI组、PEG—PEI组和Lipofectamine2000组在转染媒介中血清存在时，其转染效率分别为(14.18±0.67)％、(6.13±2.41)％和(9.78±1.53)％，与Opti—MEM组相比均呈显著下降(P＜0.01)。 8.Gal—PEG—PEI介导psiRNA转染人肝癌细胞系BEL—7402、人肝癌细胞系SSMC—7721细胞、人胎肝细胞系L—02，Gal—PEG—PEI组的转染效率均显著高于PEG—PEI组(P＜0.05)；加入半乳糖后，PEG—PEI组的转染效率无明显变化，而Gal—PEG—PEI组的转染效率显著降低(P＜0.01)。转染胚肾细胞系AD293细胞后，Gal—PEG—PEI组的转染效率与PEG—PEI组无统计学差异(P＞0.05)，加入半乳糖后二者的转染效率无明显变化(P＞0.05)。 9.Gal—PEG—PEI/psiRNA在转染肝癌细胞系HepG2、SMMC—7721、BEL—7402及正常胎肝细胞系L—02和胚肾细胞系AD293时，各细胞间的转染效率具有显著性差异(P＜0.01)。 10.转染HepG2后48h，阴性对照组、PEG—PEI组、Lipofectamine2000组、Gal—PEG—PEI组的HLA—EmRNA相对表达水平分别为1.01±0.05、1.03±0.1、0.87±0.03、0.55±0.02、0.45±0.03。Gal—PEG—PEI介导psiRNA干扰HLA—EmRNA的效率显著高于Lipofectamine2000、PEG—PEI和裸psiRNA(P＜0.01)，其干扰作用可持续7天。Westernblot检测HLA—E蛋白水平的结果与RealtimeRT—PCR相符。 结论: 1.成功合成纳米基因载体Gal—PEG—PEI。 2.Gal—PEG—PEI的细胞毒性较低，与psiRNA有较高的结合效率并对其有一定的保护作用。 3.Gal-PEG-PEI载体具有肝细胞靶向性，对肝细胞的基因转染效率高于PEG-PEI、Lipofectamine2000和裸psiRNA。 4.Gal-PEG-PEI介导psiRNA转染HepG2后可有效干扰HLA-E的基因表达。