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“胆碱能抗炎通路”是新近发现的神经.免疫调节通路,其激活可有效减少多种促炎因子的释放,对全身和局部炎症均具有明显抑制作用。尼古丁,作为一种胆碱能受体激动剂,其药理作用与乙酰胆碱Ach相似,可有效减轻炎症反应。已有文献报道尼古丁能够降低促炎因子所引起的细胞因子。TNF-α、IL-12、IL-6的释放。但到目前为止,尼古丁抗炎通路的分子机制尚不清楚。TIPE2是最近发现的一种免疫负调节分子,属于TNFAIP8家族,主要表达在胸腺、脾脏、淋巴结以及小肠粘膜等免疫器官和淋巴组织中,对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用。但TIPE2是否参与尼古丁所介导的抗炎过程,以及在其中可能所起的作用及机制尚没有文献报道。本课题首先采用皮下注射的方法给予小鼠持续的尼古丁刺激,以流式细胞术、ELISA检测小鼠脾细胞在抗原刺激下TNF-α、IL-4、IL-2及IL-12的表达情况;其次,体外诱导的巨噬细胞,尼古丁刺激后,以流式细胞术检测LPS所致的细胞因子TNF-α的释放;再次,以Westernblot、激光共聚焦研究尼古丁对巨噬细胞、RAW264.7细胞NF-κB通路的影响;继以Western blot、流式细胞术探究尼古丁对巨噬细胞、RAW264.7细胞中TIPE2、α7 nAchR表达的调控,以及α7 nAchR在尼古丁调控TIPE2表达中的作用;最后,以Western blot检测TIPE2过表达对NF-κB通路的影响,从而初步阐明尼古丁通过NF-κB通路调控炎症反应的机制。结果发现:①体内持续尼古丁刺激可使促炎因子所致的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞TNF-α、IL-4、IL-2以及IL-12的阳性细胞率分别由20％、14％、36％和75％降为13％、6％、15％和19％,细胞培养上清中IL-12、IL-4的浓度分别由1625、425 pg/ml降为139、153 pg/ml;在体外,尼古丁刺激降低LPS引起的巨噬细胞TNF-α的表达,这种降低可以被尼古丁受体阻断剂BTX逆转。②尼古丁处理可明显抑制LPS所致的巨噬细胞及RAW264.7细胞IκBα的磷酸化、降解以及p65、p50、p52的核转位。③在蛋白水平上,尼古丁刺激可明显上调RAW264.7细胞、小鼠巨噬细胞TIPE2的表达。④尼古丁刺激可上调巨噬细胞及小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞α7 nAChR的表达;同时,尼古丁α7 nAchR特异性拮抗剂α银环蛇毒素BTX或非特异性阻断剂筒箭毒碱Tc能够阻断尼古丁对TIPE2的上调作用,且BTX阻断效果更明显。⑤TIPE2过表达明显抑制IκBα的磷酸化、降解以及p65、p50、p52的核转位。
通过以上研究,我们发现尼古丁可以通过α7 nAchR上调TIPE2的表达,进而负调控NF-κB的活化,从而起到下调促炎凶子所引起的TNF-α等细胞因子的释放。本课题揭示了TIPE2在尼古丁抗炎通路中的作用及机制,为进一步探讨神经系统与免疫系统之间的联系,为人们采取新的抗炎策略和干预手段提供依据。