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研究背景:慢性粒细胞白血病是一种造血干细胞恶性疾病,近年来,慢性粒细胞白血病(慢粒)的治疗发展很快,慢性粒细胞性白血病的主要治疗方法是药物化疗、干扰素和骨髓移植治疗。最近发现一种能够治疗慢粒的新药STI571,它是一种酪氨酸激酶,作用于慢性期粒细胞,能够抑制Bcr/abl蛋白表达,临床试用效果良好,毒副作用较少。但是,根据大规模临床实验研究,由于慢粒细胞恶性克隆没有得到彻底的清除,经STI-571治疗的缓解患者较容易复发,因此,临床上探索治疗慢粒的新型药物就显得非常重要。 三氧化二砷是中国传统中药砒霜的有效成分,很早以前就被当作药物用来治疗一些疾病,但由于其副作用较大,长期未在临床上得到广泛的应用。研究表明,短期接触砷剂可产生急性中毒症状,长期接触砷剂可发生染色体变异,DNA降解,蛋白质凝集,诱发癌变。1971年,哈尔滨医科大学率先使用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病获得成功,为血液肿瘤的治疗开辟了一条新的途径。国内九十年代的资料显示,应用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病完全缓解率达到65%~84%,10年存活率达到28%,且无明显毒副作用和远期并发症,最近美国的资料也证实了砷剂在早幼粒细胞白血病中的治疗作用。 到目前为止砷剂对肿瘤细胞的作用机理尚不完全清楚。三氧化二胂可体外诱导人类早幼粒细胞白血病NB4细胞株产生凋亡的细胞形态学改变和DNA降解片段,并可减少或降解PML-RARalpha融合蛋白从而细胞诱导凋亡。现在认为,细胞凋亡是所有细胞新陈代谢的一个重要过程,是主动的程序化死亡过程。凋亡过程的延迟会导致细胞代谢的紊乱,是肿瘤发生发展的基础。因此,诱导细胞凋亡已经成为肿瘤治疗的新策略。目前国内外的研究集中在三氧化二砷对急性白血病及实体瘤的作用及其机制探讨,较少涉及对慢粒急变细胞株K562细胞的研究,本实验着重研究三氧化二砷对慢粒细胞系K562的促凋亡作用,探讨其促凋亡的可能机制。 目的:研究三氧化二砷体外对K562细胞凋亡的诱导作用,探讨三氧化二砷促进慢粒细胞系K562细胞凋亡的机制。 方法:K562细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置5%二氧化碳、37℃恒温培养箱中饱和湿度培养,备用。取对数生长的K562细胞加入不一同浓度的三氧化二砷共培养,一定时间后收集细胞进行实验,台盼蓝染色计数活细胞绘制细胞生长曲线。用不同浓度的三氧化二砷处理慢粒细胞系K562细胞,瑞氏染色和丫陡橙/滇化乙唆染色,应用普通光镜、荧光显微镜观察细胞凋亡及形态变化,抑T分析方法检测三氧化二砷对版62细胞的增殖抑制作用;琼脂糖凝胶电泳测定DNA ladder及流式细胞仪检测周期变化,采用免疫组化SABC法检测K562细胞中Be12和P53基因的表达,应用RT-PCR检测三氧化二砷处理后K562细胞株c-。ye。RNA和蛋白表达的变化。 结果:在浓度 IX 10+M8 X 10”M三氧化二砷能明显诱导 K562细胞凋亡,使细胞核DNA凝缩和核片段化,最后形成凋亡小体,产生凋亡细胞所具有的典型形态学及生化学特征;随着三氧化二砷浓度的增加和处理时间的延长,细胞凋亡率明显上升,其作用呈显著的浓度依赖性(KO.01)。4X 10”’M三氧化二砷处理l{562细胞 5天,凋亡率高达(55.9 t 5.8)%;琼脂糖凝胶电泳出现典型的 DNA梯形条带;兔疫组化显示在不同干预浓度三氧化二砷作用下的K562细胞Be12蛋 白表达与未处理组相比呈显著性下降(A0.05)。阳3 蛋白表达在三氧化二砷5X10-’~IX10-’M浓度组与未处理组相比无明显差异(P>0.05),而在ZX10-’~8 X 10加浓度组则显著下何P53蛋白表达(RO.01人流式细胞仪检测 K562细胞, 亚G;期细胞明显增多石期和乙/M期明显下降。阳62细胞在三氧化二砷作用下, 亚二倍体细胞的比例随着药物浓度的增加而上升,呈时间和浓度依赖。IX 10彻 浓度下,凋亡率为17.65%,4 X 10加浓度下三氧化二砷作用三天,细胞凋亡率 可达到 40.58%。ZX 10-’M的三氧化二砷作用分别 3天和 5天,细胞凋亡率可由 26.47%上升至 50.96%。在转录和蛋白水平,低浓度三氧化二砷处理后 c-myc 基因表达先有轻微上调,在2X10加~SX10tu高浓度三氧化二砷作用下C他yC 基因表达明显下降至较低水平。 结论:三氧化二砷可诱导K562细胞凋亡,使细胞受阻于S期而进入凋亡程 序,其作用呈剂量一时间相关性。三氧化二砷促使K562细胞凋亡的机制可能是 通过下调细胞BclZ和P53基因蛋白表达来实现的。在此过程中,c1yc基因也 可能参与了细胞凋亡的基因调节。