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牛乳β-乳球蛋白((3-lactoglobulin, β-lg)过敏严重影响婴幼儿利用优质乳蛋白,危及其身体健康,是亟待解决的食品安全问题。食物过敏发病中T辅助(T helper, Th)细胞发挥关键的免疫调节作用,以往Thl/Th2失衡一直是过敏发病的主要假说,新的研究热点提示Treg与Th17细胞比率及功能失调亦与免疫性疾病密切相关,其在p-lg过敏发生发展过程中的重要作用有待深入阐明。故本实验构建牛乳p-lg致敏动物模型,分析致敏小鼠体内Th17/Treg细胞平衡的变化及与Th1/Th2细胞失衡的关系并讨论Th17/Treg相关信号通路的变化,从而补充和完善牛乳过敏的免疫学发病机制,为牛乳过敏今后的免疫治疗开辟一个新的靶点。1.动物模型的建立和验证将购进的BALB/c雌鼠随机分成两组：生理盐水对照组和β-lg过敏组。β-lg过敏组小鼠分别于第1、7、14天腹腔注射0.2mL0.5mg/mL的过敏原(1mL弗氏佐齐(?)+1mL1mg/mLβ-1g),第16天用5mg β-1g进行末次口服激发并处死。空白组小鼠同时给予等量的生理盐水。建模期间和结束后,收集血液及脾脏等组织检测各项指标。实验结果显示,与正常组小鼠比较,经β-1g致敏后小鼠血液中总IgE, slgE的水平和炎性细胞数目显著升高(P<0.05),且组织病理学结果显示过敏组小鼠结肠和肺出现明显的炎性细胞浸润,提示成功建立动物模型。2.β-lg致敏小鼠中Thl7/Treg细胞平衡的变化采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏中CD4+IL-17+细胞和CD4+CD25+Foxp3+细胞的含量。实验结果表明,与正常组小鼠比较,致敏组小鼠脾脏CD4+IL-17+细胞占CD4+细胞的百分数显著增加,而CD4+CD25Toxp3+细胞数目则显著降低(P<0.05),且CD4+IL-17+细胞数与CD4+CD25+Foxp3+细胞数的比值从0.15±0.06增至2.16±0.62,证实牛乳过敏中存在Th17占优势的Th17/Treg细胞失衡。3.β-lg致敏小鼠中Th17/Treg失衡与Th1/Th2平衡的相关性分析通过ELISA法和RT-PCR法检测动物模型血清和脾脏中Th1/Th2相关细胞因子(IL-12、IFN-γ、IL-4)、Th17相关细胞因子和转录因子(IL-17、RORyt)及Treg相关细胞因子和转录因子(Foxp3、TGF-β和IL-10)的浓度及表达水平。结果显示致敏组小鼠呈现Th2和Th17占优势的Thl/Th2失衡和Th17/Treg失衡,且相关性分析结果表明Foxp3的含量与Thl相关细胞因子呈正相关,而与Th2相关细胞因子呈负相关；与之相反,RORyt的基因表达与Th2相关细胞因子呈正相关,而与Thl相关细胞因子呈负相关。4.β-lg致敏小鼠中Th17/Treg失衡的相关信号分析通过western blot法分析两组小鼠脾脏不同时间段pSTAT3及pSTAT5的表达情况,RT-PCR测定IL-6和IL-3的水平。发现在激发后的第1h,致敏小鼠的pSTAT3表达水平达最大值,反之,pSTAT5的含量则为最小值,且pSTAT3与pSTAT5的比值在激发后的第1h为4.4±0.3,显著高于空白对照组(0.4±0.1)(P<0.05)。此外,致敏小鼠IL-6含量增高而IL-2表达降低。以上实验结果表明,除了Th1/Th2细胞失衡外,β-lg过敏还存在Th17细胞比率的增加和Treg细胞比率的降低所致的Treg/Th17细胞比率失衡且平衡向Th17细胞一方偏移,同时伴有IL-6/STAT3活性上调而IL-2/STAT5信号通路受抑。