目的本实验以大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞为研究对象,探究弓形虫感染后,大鼠肺泡巨噬细胞的极化方向,以及细胞形态、结构变化,并进一步研究,大鼠肺泡巨噬细胞极化对弓形虫感染的影响。方法1.以正常NR8383细胞为对照组,分别用LPS(100ng/mL)、LPS(100ng/mL)+IFN-γ(20ng/mL)联合刺激巨噬细胞,采用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞极化因子的变化,Western blot检测M1型巨噬细胞标志性蛋白iNOS的变化,确定最佳诱导物及诱导时间;使用扫描电子显微镜、透射电子显微镜对诱导的细胞进行观察、鉴定。2.弓形虫感染诱导成功的M1型巨噬细胞,收集感染24h、48h的细胞,Diff染色,观察弓形虫在M1型巨噬细胞内的感染增殖情况;扫描显微镜观察M1型巨噬细胞感染弓形虫后的细胞形态变化;透射电子显微镜观察M1型巨噬细胞感染弓形虫后的细胞内部结构、细胞器的变化。3.弓形虫感染正常NR8383细胞,分别收集感染0h、6h、12h、24h、36h、48h的细胞、细胞培养上清,实时荧光定量、ELISA检测极化相关因子的变化,Western blot检测M1型、M2型巨噬细胞标志性蛋白iNOS、ARG-1的表达变化;Diff染色,观察弓形虫在正常巨噬细胞内的增殖情况;扫描显微镜观察正常NR8383巨噬细胞感染弓形虫后的细胞形态变化;透射电子显微镜观察正常NR8383巨噬细胞感染弓形虫后的细胞内部结构、细胞器的变化。结果1.实时荧光定量PCR结果显示,LPS、LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞后,TNF-a、INOS、CXCL10炎性因子明显升高,在6h达到最高值,进一步对两者6h炎性因子进行比较,LPS+IFN-γ联合刺激的表达量明显高于LPS单独刺激(P<0.05),Western blot结果显示正常组不表达i NOS,LPS+IFN-γ联合刺激iNOS的表达量高于LPS单独刺激;LPS+IFN-γ联合体外刺激巨噬细胞24h后,扫描电镜下看到细胞表面毛刺状突触明显增多,细胞体积变大,在透射电镜下可以看到,细胞核有固缩,胞质内有大量溶酶体出现,线粒体相对增多。2.Diff染色,正常NR8383巨噬细胞核质清楚,弓形虫感染24h后,细胞质内明显有弓形虫增殖,而弓形虫感染M1型巨噬细胞24h,细胞膜有变化,胞质内无弓形虫的存在;进一步在扫描电镜下观察到弓形虫感染M1型巨噬细胞24h后,细胞表面的毛刺状凸起变为圆形凸起,在感染48h后,细胞发生了明显的死亡,可见细胞碎片。3.弓形虫感染正常NR8383细胞,Diff染色结果可以看到,弓形虫能够在细胞内增殖,并随时间的延长,细胞内感染的弓形虫数也明显增多,在扫描电镜下看到,感染的细胞表面有凸起出现,透射电镜下可以看到,细胞表面凸起为棒状,胞质中出现了少量溶酶体以及大量线粒体,细胞疑似发生了凋亡;RT-qPCR结果显示,弓形虫感染后,NR8383细胞内M2型相关基因TGF-β1、ARG-1相对表达量从感染6h开始升高,24h时达到最高值,之后表达量开始下降,但仍高于正常组;CCL17相对表达量从24h开始升高,36h达到最高,48h有下降但仍高于正常组;CCL18相对表达量从12h开始升高,36h均表达上调,后期有所下降但仍高于正常组(P﹤0.05),而M1型相关因子在个别时间点升高,而其他时间点与正常组相比并无明显变化;Western blot结果显示iNOS无表达,ARG-1在感染12h后开始升高(P﹤0.01),维持至48h未见明显下降(P﹤0.01)。结论1、成功构建巨噬细胞体外极化模型;2、M1型巨噬细胞可以明显抑制弓形虫的增殖;3、弓形虫感染后诱导巨噬细胞极化为M2型。