论文部分内容阅读
树突状细胞(dendritic cells,DCs)是专职的抗原递呈细胞,研究DCs细胞的表型与功能将为提高获得性免疫应答效力的方法研究提供理论依据。本论文旨在鉴定牛外周血中表达趋化因子受体XCR1和C型凝集素受体Clec9A的DCs细胞,分析XCR1+/Clec9A+DCs的表型特征及其在牛传统DC(cDCs)群体中cDC1和c DC2亚群中的分类地位;研究DCs表面受体的配体和抗体介导的抗原靶向递呈方法,为抗原靶向性动物分子疫苗设计提供思路。利用磁珠分选、多色流式细胞术分析和qRT-PCR定量等方法鉴定了牛外周血XCR1+/Clec9A+DCs的类群。结果表明:牛XCR1与Clec9A主要表达于CD26+CADM1+CD205+MHCⅡ+CD11c+CD11b-CD4-CD8-CD163-lin-DC细胞,代表cDCs的一类,而非浆性DC(pDCs)。牛外周血中cDCs可进一步划分为CD26+CD172a-CD11c+MHCⅡ+lin-DC和CD26-CD172a+CD11c+MHCⅡ+lin-DC,分别代表cDC1和cDC2。同样的方法证实:牛XCR1的配体XCL1主要表达于自然杀伤细胞(NK)以及活化的CD8+T细胞上。趋化实验表明:鼠XCL1能够趋化牛外周血XCR1+DC的迁移。利用化学合成截短的牛XCL蛋白进行磁珠缺失分选和qRT-PCR分析,结果表明:牛XCL1二硫键片段是结合XCR1受体的关键区域。研究中使用O型FMDV多表位重组蛋白(OB7)为模式抗原,设计表达了融合XCL1的靶向抗原分子XCL-OB7及突变体△XCL-OB7,在牛体评价了XCL1介导抗原靶向免疫效果。结果表明:XCL-OB7可显著增强针对O型FMDV的中和抗体应答水平;XCL-OB7免疫组比△XCL-OB7免疫组牛产生了较高水平的FMDV特异性抗体,差异显著(P<0.05);相反,将Poly(I:C)和XCL-OB7组合免疫牛则明显抑制了体液免疫应答水平。使用10000 BID50的O型Mya98 FMDV攻毒,结果显示,单独免疫1mg或0.1mg XCL-OB7组,以及1 mg△XCL-OB7加poly(I:C)组均获得了80%(4/5)保护率;单独免疫1 mg△XCL-OB7组与1 mg XCL-OB7和poly(I:C)组分别获得60%和40%的保护率;灭活疫苗组对照获得100%保护率;PBS对照组全发病。Poly(I:C)与△XCL-OB7组合免疫组相对于XCL-OB7单独免疫组,可明显阻断病毒的复制,攻毒后10天测定FMDV非结构蛋白抗体阳性率显著低于XCL-OB7单独免疫组(P<0.01),说明DC活化诱导的细胞免疫对阻断FMDV的复制至关重要。此外,本研究中利用合成多肽免疫小鼠的方法,成功制备出了三株具有较好亲和力的抗牛Clec9A小鼠单克隆抗体,为抗体介导的抗原靶向递呈研究奠定了基础。综合以上研究结果得出:1)牛外周血中表达XCR1和Clec9A受体的DC是CD26+CADM1+CD205+CD11c+CD11b-CD4-CD8-CD163-lin-c DC;2)牛XCL1分子中二硫键片段是与XCR1受体结合的关键区域;3)证明通过牛XCL1能够明显增强特异性体液免疫应答,为靶向性分子疫苗研究奠定了基础。