1.研究背景与目的结直肠癌是全世界的第三大常见肿瘤,每年新发病例超过1000000例。在美国,结直肠癌每年约有15.4万新发病例及5.6万患者死亡,占癌症死因第2位。在我国,结直肠癌的发病率平均水平居全部恶性肿瘤的第4位,发病率每年递增4.2%,而且发病年龄明显提前,与20世纪70年代相比,在90年代城市的发病率上升了31.95%,农村上升了8.51%。2006年中国卫生统计提示大肠癌病死率位居恶性肿瘤第5位。据文献报道,肝是结直肠癌最常见的转移部位。当结直肠癌确诊时,已经有20%-25%病例发生了肝转移,而约60%的患者在其病程中会出现肝转移。治愈性根治术后再发的肝转移率为50%；结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%～71%。虽然手术切除、局部消融及立体定向放射外科是常用的治疗方法,但当原发灶不能切除或者肝功能不全时,内科治疗仍然是确实有效的重要治疗手段。目前,晚期结直肠癌的治疗以化疗为主,过去的40年里,5-氟尿嘧啶(5—FU)一直是治疗结直肠癌的主流药物,随后亚叶酸钙(CF)的加入及5-FU持续泵注使CRC患者的生存明显延长。20世纪90年代后期,新的细胞毒药物奥沙利铂(Oxaliplatin)、伊立替康(CPT-11)等问世,CRC的近期疗效和生存期均得到显著提高；近年来分子靶向药物贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)的出现,使CRC的治疗又上了一个新的台阶。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体,目前发现该受体家族包括4个亚型：EGFR(HER1/ErbB1), HER2(ErbB2), HER3(ErbB3), HER4(ErbB4)。有超过10多种配体可以选择性与EGFR单体结合。配体与受体结合后,引起受体的寡聚化作用,激活受体酪氨酸激酶,然后使得受体细胞内部分的酪氨酸残基顺式磷酸化。受体磷酸化后构象发生改变,形成停泊位点,以便与具有SH2 (Src-homology 2)结构域和磷酸化酪氨酸结合结构域的蛋白质结合,从而触发包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)通路的信号传导级联反应,在器官形成和肿瘤生长过程中的细胞增生、抑制凋亡、血管生成和转移扩散等方面发挥着很重要的作用。表皮生长因子受体(EGFR)在结直肠癌中有过量表达,为肿瘤治疗提供了一个理想靶点。EGFR过表达与细胞恶变、肿瘤细胞增侵袭、转移、肿瘤血管生成以及凋亡抗性密切相关。西妥昔单抗(Cetuximab)是一种重组人-鼠嵌合型IgG1型单克隆抗体,对细胞膜上的EGFR的亲和力是内源性配基的5-10倍,与EGFR结合后,能阻止内源性配基与EGFR结合,切断信号的传导并阻断酪氨酸激酶的磷酸化,从而抑制细胞周期进程、诱导肿瘤细胞凋亡、减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的产生,还可引起受体的二聚化、内化和下调,抑制肿瘤浸润和转移。除了抑制EGFR发挥抗肿瘤作用外,西妥昔单抗还能激活宿主的免疫反应,通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)杀伤肿瘤细胞。目前已证明用于伊立替康治疗失败的结直肠癌可提高疗效。近期多项研究均表明：在转移性结直肠癌中,K-ras野生型的患者接受西妥昔单抗联合化疗的疗效、临床获益等均显著优于K-ras突变型组,强烈提示K-ras状态与西妥昔单抗疗效相关,是独立的西妥昔单抗疗效预测指标。只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。因此,K-ras基因检测被写入2009年版《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。也就是说,所有转移性结直肠癌患者均应检测K-ras基因状态。目前认为,大肠癌的发生是机体内因(大肠癌的遗传易感性)和外因(饮食和环境因素)共同作用的结果。大量实验证明大肠癌的发生与多个癌基因的激活或抑癌基因的失活有关。Ras基因的突变被认为在癌变过程中起启动作用并是一个早期事件。Ras基因最初是在Kirston和Hayvey大鼠肉瘤中首先发现的,转导了ras基因的鼠纤维细胞能发生恶性转化,从而确定了其癌基因的地位。Ras基因家族由K-ras、H-ras和N-ras的三个密切相关的高度同源成员组成。Ras基因定位于人类的第12号染色体上,含有4个编码外显了和1个5’端非编码外显子,共同编码含189个氨基酸组成的ras蛋白,因其相对分子质量为21×103,又称为p21蛋白。K-ras的基因最常见的激活方式为点突变,突变主要发生在1号外显子的第12位密码子上,偶也有发生于13位点及2号外显子的61位点的。K-ras的基因12位密码子野生型为甘氨酸,突变型常为半胱氨酸、缬氨酸、精氨酸三种,突变的结果导致编码的氨基酸发生改变,从而产生具有致癌活性的p21蛋白。K-ras的基因发生异常时,鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性降低,p21GTP牢固结合而不被GTPase水解,一直处于激活状态,持续刺激细胞生长、发育、增殖,引起细胞恶变,大肠癌即可发生。另外K-ras的基因激活还可以通过扩增或过表达的方式,但发生频率较低,多数在动物实验中发现。Algar等研究认为,K-ras的基因过表达,明显降低自然杀伤细胞(NK细胞)对肿瘤的杀伤作用,是大肠癌转移,病情进展的特征。经研究认为,K-ras的基因突变是在肿瘤早期形成过程中即已发生,K-ras白勺基因突变更赋予肿瘤极大的浸润与转移倾向的可能。大肠癌K-ras基因突变率在欧美约为30%-68%,而台湾、日本人的K-ras突变率为26.5％-36％,较欧美的检出率偏低。Oliveira等发现K-ras基因的突变率在结直肠癌的淋巴结转移灶中比相应的原发灶高；而Molinari等报道K-ras基因在30例结直肠癌原发灶和相关转移灶的突变情况,有26例表达一致,一致率为86.6%；Daniele等分析99例结直肠癌原发灶和相关转移灶的K-ras基因突变情况,其一致率96.0%；Fotios等研究43例结直肠癌原发灶和相关转移灶的K-ras基因突变情况,一致率为95.0％。然而,原发灶K-ras基因突变情况可否作为对应肝转移灶突变情况的预测呢?上述国外这方面的报道的研究结果不尽相同,而目前国内缺乏相关的资料。本研究观察了75例结直肠癌肝转移的原发灶和对应肝转移灶中K-ras基因的突变情况,比较两者的一致性,为选用分子靶向药物提供新的依据。2.研究方法收集2003年1月1日至2008年5月30日佛山市第一人民医院同期或二期手术切除所得的结直肠癌及对应的肝转移灶病理标本75例。获取病理标本时,所有患者均未接受任何分子靶向药物治疗。所有标本经常规福尔马林固定、石蜡包埋,切成10μm厚的切片置于玻片上,应用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit组织盒分别提取肠癌组织及对应的肝转移灶组织的DNA。提取的DNA经常规PCR反应扩增K-ras基因。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定后经过DNA测序仪进行测序。采用直接测序法分别检测原发灶组织和对应肝转移灶组织中K-ras基因(主要检测第12位及第13位密码子)的突变情况。数据结果以率表示,采用SPSS13.0统计软件进行配对χ2检验,检验水准a=0.05。3.结果3.1临床资料75例患者中,男43例(57.3%),女32例(42.7%),年龄31～74岁,中位年龄54岁。同时行肠原发灶和肝转移灶切除的64例(85.3%),异时切除的11例(14.7%)。其中结肠癌肝转移55例(73.3%),直肠癌肝转移20例(26.7%)。原发部位位于右半结肠的26例(34.7%),左半结肠29例(38.6%),直肠20例(26.7%)。伴有淋巴结转移的57例(76.0%),无淋巴结转移的18例(24.0%)。组织病理类型：低分化腺癌5例(6.7%)、中分化腺癌67例(89.3%)、黏液腺癌3例(4.0%)。3.2实验结果75例中,有3例因DNA提取质量较差,不能满足后续实验要求而出组,以下为72例的结果分析。3.2.1原发灶癌组织中K-ras基因突变的情况结直肠癌原发组织中有24例(33.3％)K-ras基因为突变型,其中结肠癌18例(75.0%),直肠癌6例(25.0%)。具体突变类型：G12C有3例(12.5％),G12D有10例(41.7%), G12V有9例(37.5%),G13D有2例(8.3％)。3.2.2肝转移灶癌组织中K-ras基因突变的情况肝转移灶癌组织中有23例(31.9％)K-ras基因为突变型。具体突变类型：G12C有4例(17.4%), G12D有11例(47.8%), G12V有7例(30.5%),G13D有1例(4.3%)。3.2.3原发灶与对应肝转移灶癌组织中K-ras基因突变情况的一致性24例原发灶K-ras基因为突变型者中,有21例(87.5%)对应的肝转移灶K-ras基因为突变型。46例(63.9%)原发灶K-ras基因为野生型者相对应的肝转移灶的K-ras基因亦为野生型。原发灶及对应肝转移灶K-ras基因表达情况的一致率为93.1%,经配对资料χ2检验无统计学差异(P=1.00),其κ系数为0.842,即表示两者的吻合度较高。经对κ系数检验,P=0.00,表明两者的吻合度有统计学意义。两者不一致的情况共5例(6.9%),其中2例原发灶K-ras基因为野生型而转移灶为突变型,3例原发灶K-ras基因为突变型而转移灶为野生型。4.结论4.1.本研究中,原发灶K-ras基因突变率为33.3%,与亚洲的报道相近；而12密码子的突变的主要类型为G12D(GGT→GAT)和G12V(GGT→GTT),与上述报道的相似。4.2.本研究中,原发灶与对应肝转移灶癌组织中K-ras基因表达情况的一致率为93.1%。因此,我们认为,对于中国人来说,在转移性结直肠癌中,原发灶和对应转移灶的K-ras基因突变是基本一致的,原发灶K-ras的状态可以指导临床用药,转移灶不一定要重取活检,或如原发灶的标本无法获取时,亦可取转移灶的病理标本进行K-ras基因状态检测。这样可以减少重复的医疗操作,减少并发症,节省时间,降低医疗成本。4.3.当然,要获得更准确的资料,需要更大样本的研究以及相关蛋白表达情况的检测和临床病例的随访分析等,我们提供的这个初步研究资料希望对进一步的研究提供可靠的参考。