目的 各种病因造成心肌组织不可逆损伤均可导致心肌细胞数量减少、心肌丢失。成年心肌再生能力极差，丢失的心肌被瘢痕组织替代，心脏重构，心功能下降最终导致慢性心力衰竭的发生。如何使丢失的心肌在数量及功能上得到补偿是心血管病学家面临的一个难题。近年来，人们试图向受损局部移植有功能的细胞以使丢失的心肌得到补偿。用于研究的替代细胞主要有：胎儿心肌细胞、成年心肌细胞、骨骼肌卫星细胞及胚胎干细胞等，但这些替代细胞因来源不足或存在伦理学问题而受到一定限制。骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，近年研究表明MSCs具有多向分化潜能，可在体内外适合的条件下分化为多种组织细胞；加之MSCs来源丰富，易于获取，有望成为较上述细胞更为理想的组织替代细胞。由于MSCs的种属来源、研究方法等方面存在的差异，各家对有关MSCs生长、形态学及超微结构等报道不一。对其横向分化特性亦尚存<WP=9>争议。对MSCs的分化调控以及参与诱导其向特定组织细胞分化的因子或信号分子几乎还一无所知， 目前，已有的几项动物实验研究和1例临床实验报道，MSCs移植到损伤的心肌组织后，宿主受损的心脏功能得以改善，死亡率下降，移植细胞可以在心肌局部表达心肌特异的转录因子或蛋白质。但另有学者报道，MSCs在心肌组织中分化为心肌细胞须依赖于移植前用5-氮胞苷进行预诱导处理。因此，MSCs是否能在无辅助因子预处理的情况下在心肌组织中向心肌细胞分化尚待进一步证实。有学者认为组织局部损伤后所产生的炎症因子或细胞因子可能促使MSCs在局部的迁移和分化。有关胚胎发育及胚胎干细胞分化的研究表明，干细胞因子（stem cell factor, SCF）及其受体c-kit在胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）向特定组织迁移和分化过程中可能起着重要作用。SCF在成年心脏中是否表达以及对MSCs是否具有与ESCs类似的作用尚不清楚。SDF-1是新近发现的一种来源于骨髓基质的细胞因子(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)，属于CXCR4 (cys-X-cys receptor 4) 趋化因子家族成员。体外实验证实SDF-1对骨髓干细胞具有较强的趋化作用，在造血细胞的归巢（homing）及发育分化过程中起着重要作用。但SDF-1是否在心肌组织中表达、与MSCs在局部组织的定位和分化有无关系，目前亦不明了。如果MSCs确能依赖于环境而向所处环境中的特定细胞分化，那么在体外模拟的心肌组织环境中，MSCs是否可以向心肌细胞分化？在非<WP=10>心肌细胞占多数的心脏组织中，是心肌细胞还是非心肌细胞对MSCs的定向心肌分化起主导作用是一个有趣而又值得研究的问题。MSCs在体外具有良好的增殖潜能，使其有可能成为细胞治疗和基因治疗的良好工程种子细胞。将目的基因导入MSCs再将其移植到靶部位可对某些疾病进行基因治疗。但外源基因在MSCs是否可获得表达以及对细胞本身的生长、增殖、分化等方面的影响均有待深入研究。本课题拟以在体及离体心肌诱导MSCs向心肌分化为重点，进行以下几方面研究：(1)体外分离培养大鼠MSCs，观察其生长、增殖、形态及超微结构，并检测其部分膜抗原的表达；(2) 大鼠心脏内MSCs移植，观察不同时间点MSCs在心肌组织中的存活及分布，并对其心肌标志物的表达进行检测，探讨MSCs移植治疗心血管疾病的可行性；同时检测心肌组织内SCF及SDF-1的表达情况，评价其与MSCs在心肌组织内的存活、迁移及分化可能存在的联系；(3)体外分离培养心肌细胞，建立心肌细胞与MSCs共培养体系，检测经心肌细胞诱导后MSCs是否存在心肌标志物的表达，以证实MSCs是否具有“环境依赖性分化”特性；(4)构建pEGFP/hVEG121真核表达质粒载体，阳离子脂质体介导转染MSCs，检测其在MSCs中的表达情况，为利用MSCs作为种子细胞，进行缺血性心血管疾病的细胞及基因联合治疗提供初步的实验基础。方法 1 采用贴壁分离法分离成年大鼠骨髓MSCs，并在体外进行培养<WP=11>扩增及传代纯化，对细胞的部分生物学特性进行研究，包括：倒置显微镜下动态观察细胞贴壁、形态及生长状况；酶消化法绘制细胞贴壁曲线；MTT法绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞周期；电子显微镜观察细胞超微结构；免疫细胞化学染色法检测细胞膜抗原CD34及CD44的表达。2 用DAPI对MSCs进行荧光染色标记后，将其分别移植到正常及心肌梗死大鼠的心肌组织内，于移植后不同时间点即移植后24h、1w、2w、4w及8w处死实验动物，取心肌组织行冰冻切片，荧光显微镜下观察移植细胞在心肌组织内的分布，间接评价移植细胞的存活和迁移情况；并取移植后4w的心肌组织行石蜡切片，心肌肌钙蛋白T (cTnT)抗体行免疫组化染色，了解移植细胞向心肌细胞的分化情况。3 取正常及心肌梗死后24h、1w的心肌组织，Tripure提取组织RNA，以RT-PCR技术检测心肌组织内SCF mRNA和SDF-1 mRNA的表达情况。4 分离培养新生Wistar大鼠心肌细胞，建立心肌细胞（DAPI标记）与MSCs体外共培养体系，同时以心肌细胞培养上清液及成纤维细胞培养上清液分别与MSCs共同孵育，体外模拟心肌组织环境诱导MSCs分化，于诱导后1w左右，以免疫