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人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是能引发人体发生获得性免疫缺陷综合症即“艾滋病”的病原体。自1981年发现以来,艾滋病及HIV感染已成为一个世界性的难题。目前还没有任何有效的疫苗来预防HIV的感染,药物治疗仍是治疗艾滋病最有效的方法。药物引发对人体的副作用和某些耐药HIV病毒株的出现已经成为艾滋病药物治疗的最大困扰。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)已经广泛应用于抑制多种病毒(如HIV)的基因表达和感染的研究中。由于HIV-1病毒基因组的高突变性,单一的siRNA不能长期抑制HIV-1病毒的复制。为了解决这一问题,可以将RNAi的作用靶点选择在HIV-1病毒基因的高度保守区,同时进行多个RNAi靶点的联合抑制。这种联合抑制可以减少HIV-1逃脱RNA干扰的机率,达到持久的抑制效果。开展HIV-1的RNAi对艾滋病的预防和基因治疗都有着重要的实用价值。本研究以RNAi为主线,从vpu-RNAi与宿主抗病毒因子tetherin的联合抑制,特定HIV-1人群的gag基因的单基因RNAi和多靶位RNAi三个方面来验证RNAi对HIV-1病毒的抑制效果。Vpu是HIV-1特有的蛋白,它可以拮抗宿主抗病毒蛋白tetherin对病毒颗粒的束缚作用。为了消弱Vpu的拮抗作用并增强tetherin的抗病毒作用,我们采取了vpu-RNAi与tetherin过表达的方式联合抑制HIV-1的策略。在TZM-bl细胞中,首次采用2种慢病毒载体联合抑制HIV-1的复制。在具体实验过程中,我们以表达vpu-siRNA和tetherin的两种慢病毒以不同比例进行联合抑制HIV-1。经过对感染HIV-1的TZM-bl细胞中的Luciferase测定,vpu-siRNAi对HIV-1激活的luciferase活性抑制效率最高。实验结果证明单一siRNA可以达到比联合抑制更好的抑制效果。HIV-1有多种病毒亚型,并且该病毒在不同地区和人群中的传播和流行情况也不一样。在确认了单一siRNA的抑制效果后,我们又以天津地区男男同性恋感染HIV-1人群的HIV-1gag基因为RNAi靶点,探讨gag-siRNAi对特定HIV-1人群的抑制水平。通过对44条来自天津MSM HIV-1感染者的gag基因序列分析,我们找出了序列保守位点,并设计了5个shRNA (gag-shRNA-1～5)。通过对gag-EGFP融合基因的抑制水平,确认了gag-shRNA-3对不同亚型的gag基因和HIV-1B/C两种亚型的感染性克隆都有较高的抑制能力。在确认单一siRNA(vpu-siRNA和gag-siRNA)都有抑制效果的情况下,我们同时选取了HIV-1的结构基因(gag, env)、调控基因(tat)和辅助基因(vpu)作为RNAi的靶点。通过表达多个小干扰RNA (siRNA)的表达原件——dlhRNA (double long hairpin RNA)来实现HIV-1的多靶位抑制。本研究以含靶点序列的HIV-1基因和绿色荧光蛋白融合系统来检测RNAi的抑制效率。实验中分别构建了4个表达单个siRNA的短发夹RNA(shRNA),8个同时表达两个siRNA的长发夹RNA (1hRNA)和2个同时表达四个siRNA的双长发夹RNA (dlhRNA) o最后得到了抑制效果最好的双长发夹RNA表达原件dlhRNA-VGTE,并将dlhRNA表达原件导入FG12慢病毒载体。在TZM-bl细胞中,经过持续加入FG12-VGTE病毒(MOI=0.04)可以完全抑制HIV-1病毒的复制。本文中还利用FG12-VGTE慢病毒构建了表达dlhRNA-VGTE的VGTE-TZM-bl细胞系。VGTE-TZM-bl细胞可以抵抗HIV-1病毒的感染达10天之久。同时dlhRNA表达原件不会诱导细胞内干扰素通路的激活。所以,多靶位RNAi有望被用作HIV-1的基因治疗,为进一步展开HIV-1的基因治疗提供了参考依据。