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肿瘤细胞的两大特征是无限增殖和侵袭转移。肿瘤的生长与转移是多基因参与、多步骤发展的过程。对肿瘤生长和转移相关基因的研究将为肿瘤的防治提供靶标。LASS2基因和SLIT2基因是两个与肝癌生长和转移有关的基因,但它们在肝癌发生和转移中的作用仍不十分明了。LASS2是上海市肿瘤研究所“癌基因及相关基因国家重点实验室”发现的新基因,正式命名为LASS2(homo sapiens longevity assurancehomologue 2 of yeast LAG1)。我们前期应用酵母双杂交(Yeasttwo-hybrid)和GST pull-down技术进行筛选的结果显示:LASS2基因表达的蛋白能与V-ATPase(Vacuolar H~+-ATPase)质子泵中的c亚基相互结合。c亚基又称ATP6L(16 kDa proteolipid subunit of vacuolarH~+-ATPase),它是V-ATPase质子泵的关键跨膜部分,组成运输质子的孔道。对该基因的初步研究显示,其能抑制肝癌细胞的克隆形成(Colony formation),提示LASS2对癌细胞的生长有调控和影响作用。生物信息学研究发现LASS2与TMSG1一致。在将二者的ORF、氨基酸序列进行对齐分析后发现,TMSG1应当是LASS2的一个片段。TMSG1(Homosapiens tumor metastasis-suppressoy)在前列腺癌细胞系PC-3M不转移亚系284高表达,而在高转移亚系1E8低表达,而且TMSG-1基因表达水平的降低与肿瘤转移潜能的提高具有相关性。提示LASS2对癌细胞的转移有影响作用。我们前期的研究结果也表明当V-ATPase质子泵中的c亚基ATP6L被干扰后,肿瘤细胞通过V-ATPase质子泵跨质膜外排氢离子的能力明显下降,相应的肿瘤细胞的侵袭转移能力、MMP-2/9等蛋白水解酶的活性亦显著下降。在本文中,我们使用真核表达载体pCMV-HA2-LASS2,pCMV-Myc-ATP6L,pEYFP-C1-LASS2,pECFP-N1-ATP6L等瞬时转染HCCLM3细胞,通过蛋白亚细胞共定位实验、CO-IP(免疫共沉淀)实验对LASS2与ATP6L的相互结合进行研究。我们的研究结果证明了两个蛋白在细胞内特异性结合。并且通过合成一系列的LASS2的缺失突变体,确定了LASS2(181—255)缺失体是LASS2与VPL结合的最小结构域。为了进一步探讨LASS2基因在肿瘤生长转移中的作用,我们构建了LASS2、LASS2(181-255)(LASS2与VPL结合区域)、LASS2(310-380)(LASS2与VPL不结合区域)重组腺病毒载体,并将其转染至高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3,通过MTT,凋亡实验,划痕实验及体外侵袭实验,证实了LASS2基因及LASS2与VPL结合区域——LASS2(181-255)在HCCLM3细胞中过表达后,HCCLM3细胞在生长、迁移、侵袭等转移能力上受到了明显的抑制,且HCCLM3细胞生长受阻与LASS2凋亡诱导作用有关,这提示着这种抑制与LASS2和VPL的相互作用有关。我们采用Western blot、明胶酶谱方法,分析了HCCLM3细胞过表达LASS2基因后,MMP-2在合成、分泌及激活等方面的变化。结果显示,LASS2基因对HCCLM3细胞合成MMP-2并无影响,但令HCCLM3细胞降低了MMP-2的分泌,更明显抑制了MMP-2的激活。同时,我们可以观测到,LASS2基因及LASS2与VPL结合区域LASS2(181-255)在HCCLM3细胞中过表达后细胞的pHe(细胞外pH)上升;pHi(细胞内pH)在NH4+诱导酸化后恢复受阻。pHi酸化后的恢复是V-ATPase的功能指标之一。该结果提示,LASS2可以抑制V—ATPase的泌H+能力,从而对肿瘤外周酸性微环境的形成具有抑制作用。综合以上结果,提示LASS2基因对V—ATPase的泌H~+能力具有抑制作用,而LASS2对细胞生长、迁移、侵袭、MMP-2活性的抑制作用和凋亡的诱导作用的机制与LASS2蛋白结合ATP6L亚基并抑制其泌H~+能力相关。SLIT2基因与其受体ROBO(Roundabout)是调控神经细胞正常运动和神经轴突生长正确方向的“神经导向因子”中的一类。最近的研究表明,SLIT2作为一个新的抑癌基因,在多种肿瘤中发生启动子区高甲基化,包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和神经胶质瘤等。在本文中,我们首次报道SLIT2基因在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)中甲基化状态及表达情况。实时定量PCR研究基因表达;MSP和测序法研究基因甲基化情况。结果显示,75%(6/8)的肝癌细胞系、83.3%(45/54)的肝癌病人癌组织发生甲基化,且甲基化水平与基因表达相关。在甲基化导致SLIT2低表达的细胞系中,用甲基化酶抑制剂(5-Aza-dC)处理后能恢复其表达。且临床资料显示,SLIT2的甲基化与与患者淋巴转移有关。在进一步的研究中,我们在基因由于甲基化而低表达的肝癌细胞系SMMC7721中用腺病毒载体过表达SLIT2,发现细胞的生长、迁移和侵袭能力受到抑制。以上结果表明,SLIT2的表观遗传学的失活在HCC的发生发展中起了重要的作用,SLIT2可作为HCC治疗的有效靶标。本文首次报道LASS2基因通过与ATP6L特异性结合抑制V—ATPase的泌H~+能力而抑制肝癌细胞的生长与转移。同时首次证明了SLIT2的表观遗传学的失活在HCC的发生发展中起了重要的作用。本文的结果为研究肿瘤发生和转移机制以及探索抑瘤方法提供了参考。