植物多糖是一类广泛存在于植物中具有多种生物学活性的天然大分子物质,大量的药理和临床研究表明,植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、抗辐射、降血糖等多种功能。其中有关植物多糖的免疫调节活性倍受关注,是当前多糖研究最活跃的领域之一。研究表明,植物多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用,不仅能够激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞,还能活化补体,促进细胞因子生成等,对免疫系统产生多方面调节作用,尤其是对巨噬细胞免疫调节功能的影响。巨噬细胞是机体免疫系统中的重要成员之一,作为免疫效应细胞广泛参与免疫应答反应。研究发现植物多糖激活巨噬细胞释放活性氧、分泌细胞因子和趋化因子等是其发挥免疫调节作用的重要方式。芦笋(Asparagus officinalis. L)是一种质地优良、营养丰富的保健型蔬菜,研究发现芦笋提取物具有抗癌、降血脂、增强免疫功能、抗衰老等药理作用。芦笋多糖是芦笋含有的重要活性物质之一。本实验以芦笋为原料从中分离提取多糖,研究芦笋多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响及作用机制,以期对芦笋多糖的免疫调节机制进行深入研究,为芦笋多糖开发提供理论依据。首先,新鲜芦笋原料鼓风干燥,粉碎得到芦笋干粉;芦笋干粉采用热水浸提法提取芦笋粗多糖,得率为8.5%;分别采用Sevage法、酶结合Sevage法、三氯乙酸法去蛋白处理,多糖得率分别为1.5%、2.2%、3.6%。三氯乙酸去除蛋白后的粗多糖经不同浓度乙醇分级得三种多糖样品,分别为E 40、E60、E 80,其中E60组分得率最高,得到0.426克,E60经DEAE52纤维素柱层析,得到两种层析样品:A、B,对层析样品A进行红外光谱分析和原子力显微镜形貌观察。其次采用Griess法测定芦笋多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响。结果显示,各组分多糖均可促进小鼠巨噬细胞释放NO,在一定浓度范围内(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml),随着多糖浓度增加,刺激作用增强,呈剂量依赖关系;随着作用时间的延长,其刺激效应也增强,呈现时间依赖性。采用DAF-FM DA NO荧光探针检测细胞内部产生的NO,激光共聚焦显微镜下观察,结果表明多糖作用6h细胞内部即产生NO。巨噬细胞释放的NO作为重要的生物活性分子广泛参与生理和病理过程,可杀伤微生物(细菌、真菌、病毒)、寄生虫和肿瘤细胞等,保护机体抵御外界不利因素的侵害。同时采用MTT法检测多糖对巨噬细胞增殖的影响,结果显示不同组分芦笋多糖可促进巨噬细胞的增殖,表明芦笋多糖对巨噬细胞无细胞毒性。再次,采用RT-PCR法检测芦笋多糖对巨噬细胞iNOS基因表达的影响,结果显示多糖作用6h即可刺激巨噬细胞iNOS mRNA的表达,据此推测芦笋多糖是通过激活巨噬细胞iNOS基因的表达而刺激其释放NO。最后采用RT-PCR法检测芦笋多糖对巨噬细胞表达细胞因子模式的影响,实验结果表明,芦笋多糖作用6h即可激活巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-6基因的表达。