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胶质瘤是一种常见的神经上皮恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的30%-60%。发病原因仍不很清楚,对其治疗至今尚没有明显进展,主要停留在手术治疗结合放化疗阶段,但胶质瘤浸润生长,与正常脑组织界限不清,也在一定程度上降低了放化疗的效果,故临床上需要结合有效的药物进行化学治疗。通过药物抑制胶质瘤细胞的增殖,这也成为临床上治疗胶质瘤的一个研究方向。泛素蛋白酶体通路是细胞内降解蛋白质的主要通路,广泛参与生物体的基本生物化学过程,涉及细胞生长、增殖、分化、凋亡等,其通路的异常与诸多疾病如肿瘤、神经变性疾病、遗传性疾病、炎症、血液病等疾病的致病机制相关。蛋白酶体抑制剂则通过UPP阻断抗肿瘤蛋白分子的降解达到抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的目的,蛋白酶体抑制剂作用于正常细胞可引起细胞周期阻滞,作用于肿瘤细胞则了诱导肿瘤细胞凋亡,但机制尚不十分清楚。细胞凋亡主要有线粒体途径、内质网途径及死亡受体途径,Caspase-3是细胞凋亡的主要反应酶。线粒体途径中Cytc变化引起细胞膜电势变化是细胞凋亡线粒体途径的关键。本实验通过MTT、RT-PCR、Rh123、Western Blotting等方法进行实验研究,测定细胞中Bcl-2/Bax、Caspase-3的表达及细胞膜电势的变化来确定凋亡途径及蛋白酶体抑制剂对U251的抑制作用。实验目的:观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin (LAC)对U251细胞增殖率的影响,并探讨其与细胞凋亡间的关系及临床意义,为临床上通过药物治疗神经胶质瘤提供一定的研究方向和理论依据。实验方法:通过体外培养胶质瘤U251细胞,选择处于对数生长期的细胞进行实验。实验分组为对照组(Con)与LAC 5μmol.L-1组(5μmol.L-1)、LAC 10μmol.L-1组(10μmol.L-1)及LAC 15μmol.L-1组(15μmol.L-1),通过MTT方法检测各组细胞增殖率的变化,RT-PCR检测细胞中Bcl-2/Bax蛋白及caspase-3表达;共聚焦显微镜检测线粒体膜电势以及U251细胞核的变化。实验结果:1、MTT检测显示,与Con组相比,LAC 5μmol.L-1组、LAC 10μmol.L-组及LAC 15U251细胞存活率明显降低(P<0.05)2、RT-PCR电泳检测显示,与Con组相比,LAC 5μmol.L-1组、LAC10μmol.L-1组及LAC 15μmol.L-1组Bcl-2/Bax水平明显降低(P<0.05),caspase-3表达水平明显升高(P<0.05),说明线粒体途径参与细胞凋亡。3、Rhodamine123检测显示,与Con组相比,LAC 5μmol.L-1组、LAC 10μmol.L-1组及LAC 15μmol.L-1组U251细胞内红色荧光强度明显减弱,说明线粒体膜电势明显减低,提示细胞凋亡。4、Hoechst 33342检测显示,与Con组相比,LAC 5μmol.L-1组、LAC 10μmol.L-1组及LAC 15μmol.L-1组U251细胞形态发生明显的改变,细胞核明显的皱缩,核分裂明显,提示凋亡的发生。5、Western blotting电泳检测显示,与Con组相比,LAC 5μmol.L-1组、LAC 10μmol.L-1组及LAC 15μmol.L-1组Bcl-2/Bax水平明显降低(P<0.05),提示线粒体凋亡途径参与了这个过程。实验结论:1、蛋白酶体抑制剂LAC能够降低U251细胞增殖率。2、蛋白酶体抑制剂LAC能诱导U251凋亡3、蛋白酶体抑制剂LAC可能通过线粒体途径诱导胶质瘤U251凋亡。