研究背景：现代金属-金属（MOM）人工髋关节置换系统提高了假体的耐磨性和抗疲劳强度，在临床上表现出优良的早中期效果。作为植入材料，不可避免地面对机械物理、电化学腐蚀等多种因素造成的降解，形成具有化学活性的产物。大量研究表明，MOM术后患者血液、尿液中钴、铬离子浓度显著升高。值得一提的是，假体周围组织中发现超细直径的金属颗粒（6-834nm），主要是含钴基的纳米颗粒。病例研究显示，部分翻修假体周围出现广泛滑膜溃疡伴淋巴细胞、浆细胞浸润；“炎性假瘤”形成—含有血管、坏死组织及多核巨细胞的肉芽肿样改变，且金属磨屑沉淀其中，局部淋巴结凝固性坏死。同时，假体植入时间的延长伴随外周血淋巴细胞染色体易位率和染色体非整倍体率提高，T细胞、白细胞和骨髓细胞水平下降；部分患者血清中发现钴、铬特异性Ig E。体外研究表明，金属纳米颗粒自身尺寸效应带来了有别于宏观粒子及相应离子的生物学效应。因此，探讨钴纳米颗粒（CoNPs）对机体免疫系统的生物学效应及其机制具有重要意义。第一部分钴纳米颗粒对外周血T淋巴细胞的细胞毒性和遗传毒性作用目的：研究钴纳米颗粒（CoNPs）对外周血T淋巴细胞的细胞毒性和遗传毒性作用，同时以钴离子(Co²⁺)作为比较研究，初步探讨MOM术后一系列复杂生物学反应的病因。方法：以正常外周血T淋巴细胞作为试验系统，采用不同浓度的CoNPs和Co²⁺对细胞进行处理，在不同时间点利用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）及乳酸脱氢酶（LDH）分析方法检测细胞生存率，利用彗星试验（Comet assay）及微核试验（MNT）检测细胞DNA和染色体损伤，评估CoNPs和Co²⁺的细胞毒性和遗传毒性。同时，使用ICP-MS（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry）检测手段，评估CoNPs细胞外释放离子的情况。结果：（1）CoNPs及Co²⁺对外周血T淋巴细胞的细胞毒性效应呈现时间、浓度依赖性（2）CoNPs、Co²⁺细胞毒性起效浓度分别约为10、50μM，4h CC50分别为10、50μM，说明CoNPs的细胞毒性效应强于Co²⁺。（3）50、100μM CoNPs在4、24、48h释放（%）分别为5.12±1.44、14.22±3.17、32.78±2.70及6.27±2.49、18.78±4.29、38.81±2.11，随着时间的延长离子释放逐步增加，呈现时间依赖关系（P<0.001）。各时间点释放的浓度均小于Co²⁺细胞毒性起效浓度（50μM），提示CoNPs的细胞毒性作用并不依赖于细胞外Co²⁺释放。（4）LDH实验结果和MTT吻合。（5）CoNPs在3、6μM剂量，尾部DNA含量分别为8.73±4.60、9.64±4.77，Olive尾矩分别为2.16±1.19、9.66±4.73与溶剂对照组尾部DNA含量（1.46±0.76）和Olive尾矩（0.35±0.21）相比均有显著差异（P<0.01）；Co²⁺各剂量组尾部DNA含量和Olive尾矩与溶剂对照组相比均无显著差异（P>0.05）。结果说明，CoNPs可以引起外周血T淋巴细胞DNA链断裂，导致初始DNA损伤；本研究设计的浓度及染毒时间内，未发现Co²⁺造成T淋巴细胞DNA损伤。（5）CoNPs在6μM剂量，微核率（BNMN（‰））为13.69±1.85，与对照组（5.46±1.28）相比有显著差异（P<0.05）；Co²⁺各剂量组微核率与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。说明CoNPs可以引起外周血T淋巴细胞染色体损伤；本研究设计的浓度及染毒时间内，未发现Co²⁺造成T淋巴细胞染色体损伤。结论：（1）CoNPs可以对人免疫细胞产生细胞毒性及潜在遗传毒性作用，可能是通过自身特殊动力学行为介导，不依赖于细胞外Co²⁺释放，且毒性作用强于Co²⁺。（2）试验结果部分解释了MOM术后假体周围炎性假瘤形成、外周血免疫细胞减少及染色体畸变的原因。（3）本研究无法排除CoNPs和Co²⁺是否存在协同效应，有待后续深入探讨。第二部分钴纳米颗粒对外周血T淋巴细胞生物学效应机制的研究目的：研究CoNPs的表征特性、介质中分散情况、是否能进入细胞、细胞处理后的氧化应激水平，初步探讨CoNPs生物学效应的机制。方法：以PBS及含血清培养基作为溶剂，利用TEM观测CoNPs分散情况，同时检测CoNPs的粒径分布。细胞经过CoNPs处理后固定、脱水、浸、包埋、切片、染色，借助TEM观测CoNPs进入细胞的情况。CoNPs和Co²⁺分别对细胞进行染毒，采用荧光分光法检测细胞内活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽还原酶法检测还原型谷胱甘肽（GSH）水平、邻苯二酚氧化法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力、H2O2还原法检测过氧化氢酶（CAT）活力、GSH氧化法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活力。结果：（1）CoNPs在不同的溶剂中解聚情况有所区别：5%人AB血清RPMI-1640培养液为溶剂时解聚效果优于PBS溶剂；同时，CoNPs的粒径分布平均为50nm。（2）细胞胞浆中出现致密CoNPs团块，外形上类似一整体的大尺寸颗粒，其电子密度高于细胞质，细胞膜未见破坏，细胞核未见CoNPs积聚。（3）相比较对照组，CoNPs处理组相对荧光单位（RUF）升高具有统计学意义（P<0.05），间接说明CoNPs可以导致T淋巴细胞内ROS明显升高，自由基蓄积；Co²⁺处理组RUF升高无统计学意义（P<0.05）。（4）CoNPs处理组GSH值8.74±2.41μM/mg protein，相比较对照组GSH值15.27±1.32μM/mg protein，差异显著（P<0.05）；Co²⁺处理组GSH值13.62±0.85μM/mg protein，无显著差异（P>0.05）。说明CoNPs可以导致T淋巴细胞内GSH明显下降，细胞处于氧化应激状态。（5）CoNPs处理组SOD、CAT、GPx水平分别为8.92±0.57、6.33±0.46、6.15±0.64U/mg protein，相比较对照组12.46±1.02（SOD）、11.21±0.60（CAT）、11.87±0.89（GPx）U/mg protein，差异显著（P<0.05）；Co²⁺处理组SOD、CAT、GPx水平分别为10.71±0.48、10.11±0.61、11.03±1.29U/mg protein，无统计学差异（P>0.05）。结论：（1）CoNPs血清悬浮体系稳定性较高，有利于机体内血液、淋巴液转运及生物学效应作用。（2）CoNPs可以高效便捷地进入T淋巴细胞，而不依赖细胞的吞噬功能。（3）CoNPs可引起外周血T淋巴细胞内ROS蓄积，同时破坏细胞抗氧化防御机制，导致自由基的产生与清除处在失衡状态，诱导氧化应激损伤；亚毒性浓度的Co²⁺短期处理不会引起T细胞氧化应激损伤（<CC50）。