奶牛子宫内膜炎是奶牛的主要疾病之一,主要是由病原微生物的感染引起,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。目前,缺少针对引起奶牛子宫内膜炎炎的主要病原菌的准确而快速的检测方法;尤其对奶牛子宫内膜炎的主要病原菌缺少分子流行病学资料,国内外还缺少预防奶牛子宫内膜炎效果较好的疫苗,我国众多奶牛散养户在顽固性子宫内膜炎面前束手无策等等,为探讨、解决以上问题,进行了本项研究。本研究分为两个部分:第一部分:奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定对山东省济南、泰安两个地区子宫内膜炎的患牛采样并进行致病菌的分离鉴定。首先进行细菌的常规分离、纯化、培养并大致进行分类。本试验利用16S rRNA结构的特点,根据外文资料,选用特异性的引物,利用PCR方法扩增未知菌株的16S rRNA基因,将扩增产物与pMD19-T载体连接构建克隆载体,经PCR和双酶切正确后测序,并将其结果与GeneBank中的收录菌进行同源性比较。结果表明,引起奶牛子宫内膜炎的致病菌有:SD01为琼氏不动杆菌;SD02为粪肠球菌;SD03为金黄色葡萄球菌;SD04为中间葡萄球菌;SD05为溶血葡萄球菌;SD06为鲁菲不动杆菌;SD07为无乳链球菌;SD08为芽孢杆菌;SD09为枯草芽孢杆菌;SD10为大肠杆菌;SD11为假单胞杆菌。通过国际公认的16S rRNA序列鉴定技术成功准确鉴定引起奶牛子宫内膜炎的致病菌的种类,这对于奶牛子宫内膜炎的防治具有重要的指导意义。第二部分:金黄色葡萄球菌血浆凝固酶基因的原核表达及生物活性分析血浆凝固酶(coagulase,coa)是金黄色葡萄球菌的主要毒力因子之一,该基因含有一个ORF,全长2106bp,共编码701个氨基酸。利用PCR技术从金黄色葡萄球菌临床分离株的全基因组扩增出编码血浆凝固酶的基因,经克隆筛选和测序鉴定后,构建成该基因的原核表达质粒pET32a+/coa,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析,结果表明:coa基因在大肠杆菌中已融合表达,融合蛋白的分子量为100KD。血浆凝固试验证明该融合蛋白具有凝固血浆的作用,其效价达0.012mg/mL,表明表达产物具有生物活性,这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。