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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种给全球养猪业带来巨大经济损失的革兰氏阳性病原菌,血清型众多（1-32型和1/2型）。其中临床分离率最高的猪链球菌2型（SS2）是一种人兽共患病原菌,可定植在宿主的扁桃体中,穿越粘膜屏障,造成菌血症,感染不同的组织引起猪和人不同的症状;例如关节炎、脑膜炎、肺炎心内膜炎、全身性感染休克等。近年来研究学者对猪链球菌2型的关注度越来越高,许多毒力相关因子已经被确定,如荚膜多糖、分泌型核酸酶、溶血素等。但确切的猪链球菌2型入侵宿主、逃避宿主免疫监测并致病的机制所知甚少。因此,本课题以猪链球菌2型SsPepO为研究对象,发现它是一个纤溶酶原结合蛋白,有助于猪链球菌2型在宿主内的定植与扩散,并参与免疫逃避。本课题目的是为研究细菌与宿主的相互作用,从而为最终防控猪链球菌病提供更多的理论依据。本课题组谭臣博士构建了ΔSsPepo（SSU050153）缺失株。研究表明,相比于野生株SC19,ΔSsPepo（SSU050153）缺失株对仔猪的致病性明显减弱,对Hep-2细胞粘附能力减弱,SsPepo基因是猪链球菌2型的一个毒力因子。李锦铨博士原核表达重组SsPepO蛋白,重组SsPepO蛋白能够对致死剂量的SS2攻毒小鼠和猪提供良好的免疫保护力,在全血杀菌实验中,抑制SS2的生长;SsPepO可作为亚单位疫苗候选者。鉴于以上背景,我们进一步研究猪链球菌2型SsPepO的生理学功能。主要研究内容如下:1.SsPepO的生物信息学分析通过NCBI上公布的强毒株05ZYH33的SsPepo基因进行序列分析,它是一个锌金属蛋白酶;通过BLAST比较分析发现,SsPepO蛋白在SS2菌株中序列高度保守,属于M13金属多肽酶家族,跟肺炎链球菌纤溶酶原和纤连蛋白结合蛋白PepO的同源性为29%。2.SsPepO蛋白的克隆表达及蛋白纯化以强毒株SC19基因组为模板,根据SsPepo基因设计引物进行PCR扩增1893bp大小的目的片段,用Nde I和Xho I酶切连接到载体pET-30a上,转化大肠杆菌DH5a,鉴定正确后再转化到大肠杆菌DE3进行原核表达,得到SsPepO重组蛋白。用Ni-NTA镍柱进行SsPepO蛋白纯化,最终得到纯度大于90%的目的蛋白。3.SsPepO与纤溶酶原和纤连蛋白结合验证用ELISA法证实SsPepO与纤溶酶原、纤连蛋白相互作用且成剂量依赖性,纤溶酶原结合SsPepO跟纤连蛋白不存在竞争关系。SsPepO结合纤溶酶原由赖氨酸残基介导,结合方式与离子键有关。通过SPR实验计算出SsPepO与纤溶酶原的亲和力常数为105 nM。SsPepO蛋白结合纤溶酶原,经过尿激酶纤溶酶原激活物uPa激活后,产生具有活性的纤溶酶复合物,能够降解补体C3b参与补体调控。4.ΔSsPepo缺失株体内生物学功能研究相比于野生株SC19,ΔSsPepo缺失株对鼠脑血管内皮细胞的入侵能力和粘附能力下降,对人脑血管内皮细胞的粘附能力减弱。通过不同的攻毒方式来比较缺失株和野生株的毒力差异,结果发现,腹腔攻毒缺失株与野生株的毒力差异不明显,而尾静脉攻毒,ΔSsPepo缺失株的毒力减弱。在组织载菌量实验中,攻毒24h后,ΔSsPepo缺失株定植在肺脏、脑器官和血液中的菌量与野生株相比无明显的差异。总之,SsPepO是一个纤溶酶原和纤连蛋白结合蛋白,在猪链球菌入侵和粘附宿主细胞和免疫逃避中扮演着重要的角色。