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癌症是世界范围内的一个主要公共卫生问题,是二十一世纪世界上大多数国家的主要的死亡原因和提高预期寿命的最重要障碍,并且其发病率和死亡率在全世界迅速增长。尽管目前在癌症的诊断和治疗方面取得了重大进展,但癌细胞转移仍然是患者获得良好临床效果的主要障碍,因为90%以上与癌症有关的死亡是由肿瘤转移所造成的。在癌症中,肿瘤的发生,侵袭,转移,以及肿瘤抵抗治疗与上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)有着密切的联系。大量研究结果发现,转化生长因子(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)是EMT最有效的诱导剂之一,其可以通过Smad及非Smad通路促进癌细胞EMT的形成。异佛来心苷(Isoviolanthin)是名贵中药铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)中的黄酮碳苷成分,其抗肿瘤转移作用机制至今未见相关报道。本研究采用TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402的EMT作为癌细胞体外转移模型,探讨异佛来心苷对TGF-β1增强的肝癌细胞迁移,侵袭和EMT的影响,以及其相关的作用机制,本研究结果将为铁皮石斛黄酮类成分的抗肝癌体外转移活性提供研究基础和依据。目的:基于TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路,探讨异佛来心苷对TGF-β1诱导两种人肝癌细胞HepG2及Bel-7402的EMT的调控效应。方法1.MTT法检测0-100 μM异佛来心苷对人正常肝细胞L02和人肝癌细胞HepG2及Bel-7402活性的影响,以确定合适的异佛来心苷浓度用于后续EMT实验。2.克隆形成实验检测异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)对TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402克隆数量的影响。3.划痕实验检测异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)对TGF-β1增强的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402迁移能力的影响。4.Transwell小室实验检测异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μìM)对TGF-β1增强的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402侵袭能力的影响。5.酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)检测异佛来心苷(2.5μM,5 μM,10 μM)对TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)MMP-2 及 MMP-9 的影响。6.逆转录实时荧光定量 PCR(Reverse transcription-quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)实验检测异佛来心苷(2.5μM,5μM,10 μM)对TGF-βl诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮标记物E-cadherin和ZO-1,间质标记物N-cadherin及vimentin,转录因子Snail及Slug的mRNA表达的影响。7.蛋白质印迹实验(Western boltting assay)检测异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10μM)对TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮标记物蛋白E-cadherin和ZO-1,间质标记物蛋白N-cadherin及vimentin,转录因子蛋白Snail及Slug,基质金属蛋白酶蛋白MMP-2及MMP-9的影响,以及TGF-β1诱导的TGF-β/Smad和PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响。8.免疫荧光实验(Immunofluorescence assay)观察10 μM异佛来心苷对TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮标记物蛋白E-cadherin,及间质标记物蛋白vimentin的影响。9.划痕和 Transwell 小室实验检测 20 μM TGF-β/Smad 抑制剂 SB4β1542,20 μM P13K/Akt抑制剂LY294002对TGF-β1诱导的人肝癌细胞HepG2及Bel-7402的迁移及侵袭能力的影响。Western boltting实验检测SB431542和LY294002对TGF-β!诱导的人肝癌细胞 HepG2 及 Bel-7402 中 E-cadherin,N-cadherin,Snail,及 MMP-2 的影响。结果1.MTT结果显示100μM异佛来心苷浓度对人正常肝细胞LO2无明显细胞毒性作用,低浓度(<10μM)异佛来心苷对人肝癌细胞HepG2及Bel-7402无明显细胞杀伤作用,但异佛来心苷呈剂量-时间依赖性抑制HepG2及Bel-7402细胞活性。2.克隆形成实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)剂量依赖性抑制TGF-β1增加的HepG2及Bel-7402细胞克隆数量。3.划痕实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)剂量依赖性抑制TGF-β1增强的HepG2及Bel-7402细胞迁移能力。4.Transwell小室实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)剂量依赖性抑制TGF-β 1增强的HepG2及Bel-7402细胞侵袭能力。5.ELISA实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)剂量依赖性减弱TGF-β1增强的HepG2及Bel-7402细胞分泌MMP-2及MMP-9的能力。6.RT-qPCR实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)剂量依赖性减弱 TGF-β1 增强的 HepG2 及 Bel-7402 细胞"N-cadherin,vimentin,Snail,Slug 的 mRNA基因表达水平,并增强TGF-β1减弱的E-cadherin和ZO-1的mRNA基因表达水平。7.Western boltting实验结果表明异佛来心苷(2.5 μM,5μM,10μM)剂量依赖性减弱 TGF-β1 增强的 HepG2 及 Bel-7402 细胞 N-cadherin,vimentin,Snail,Slug,MMP-2及MMP-9蛋白表达水平,并增强TGF-β1减弱的E-cadherin和ZO-1蛋白表达水平;异佛来心苷显著降低TGF-β1诱导的HepG2及Bel-7402细胞TGF-β/Smad和 PI3K/Akt 信号通路相关蛋白 p-Smad2,p-Smad3,p-Akt,p-mTOR,和 p-P70S6K表达水平。8.免疫荧光实验结果表明10μM异佛来心苷明显增强TGF-β1减弱的HepG2及Bel-7402 细胞 E-cadherin 表达,减弱 TGF-β1 增强的 vimentin 表达。9.划痕和Transwell小室实验结果表明抑制剂SB431542和LY294002显著降低TGF-β1增强的HepG2及Bel-7402细胞迁移和侵袭能力;Western boltting实验结果表明SB431542和LY294002显著增强TGF-β1减弱的E-cadherin蛋白表达水平,显著降低TGF-β1增强的N-cadherin,Snail和MMP-2蛋白表达水平,抑制剂实验结果与10 μM异佛来心苷实验结果一致。结论本研究首次证明了异佛来心苷可以通过抑制TGF-β1诱导的TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HepG2及Bel-7402细胞的迁移,侵袭和EMT。实验结果表明了异佛来心苷可以作为铁皮石斛发挥抗肝癌细胞转移作用的活性成分之一。