细胞色素c (cytochrome c, Cyt c)是一种定位于线粒体内外膜间隙的血红素蛋白。它广泛存在于各种含线粒体呼吸链的生物体中,如细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物等。Cytc分子量约为13,000道尔顿,是唯一能溶于水的细胞色素。它具有c型血红素辅基,血红素heme的中心Fe与蛋白肽链上的组氨酸残基(Hisl8)的N原子、甲硫氨酸残基(Met80)的S原子及血红素卟啉环的四个N原子配位,同时血红素heme的两个乙烯基还与蛋白肽链上的两个半胱氨酸残基Cysl4、Cysl7形成了两个硫醚键。Cyt c分子由肽链将c型血红素辅基紧紧包裹在其中,分子近似为球形。这些结构特征使得Cyt c分子非常稳定。Cyt c是一种非常古老的蛋白,产生于生命起源的早期。它在细胞的能量代谢中起着至关重要的作用,通过血红素辅基heme中心Fe离子的价态变化在细胞色素c还原酶(cytochrome c reductase)与细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)之间传递电子。几十年来,Cyt c作为一个电子传递蛋白其结构、性质与功能已经得到了广泛而深入的研究。然而,近十几年来人们发现Cyt c竟然在另一个重要的生命过程——细胞凋亡(apoptosis)中也扮演了至关重要的角色。1996年,王晓东课题组发现在细胞程序性死亡(细胞凋亡)的最初阶段,线粒体会将Cyt c释放到细胞质中,Cyt c与凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)结合后形成凋亡体(apoptosome),从而激活胱冬肽酶-9 (caspase-9)与下游caspases,启动细胞凋亡。2005年,Kagan课题组进一步发现Cyt c还参与细胞的“促细胞凋亡通路”(pro-apoptotic pathway)。在线粒体中当Cyt c与线粒体膜上的心磷脂(cardiolipin)结合后,会发生一种构象变化而获得很高的过氧化物酶活性,从而将cardiolipin氧化,氧化的cardiolipin激活下游通路使得线粒体外膜的通透性增加,释放出Cyt c与其它的促细胞凋亡因子,启动细胞凋亡。这些发现表明了Cyt c这个古老的小蛋白竟然同时掌控着细胞的生存和死亡,重新激起了人们对Cyt c研究的极大兴趣。近几年,随着对Cyt c研究的深入,人们渐渐意识到Cyt c的构象变化与其功能的多样性有着直接的联系。目前有两种构象变化最受关注,一种被称作“促细胞凋亡构象转换”(pro-apoptotic conformational transition),另一种被称作“碱式构象转换”(alkaline conformational transition)。Cyt c发生促细胞凋亡构象转换的分子机理目前还完全未知,而Cyt c的碱式构象转换的机理与其真正的生理意义也十分不清楚。因此,为了阐明Cyt c的这两种构象变化的机理与生理功能,我们对其进行了深入而系统的研究。首先,Cyt c的促细胞凋亡构象转换,是Cyt c与线粒体膜结合时,所发生的一种与过氧化物酶活性密切相关的构象转换。这种构象变化于2005年首次被发现,它发生的机理至今仍完全未知。我们注意到在Cyt c内部有一个高度保守的氢键网络。这个氢键网络由Cyt c的第67位氨基酸残基(Tyr67)所维系,Tyr67通过氢键与轴向配体Met80相连,同时通过一个蛋白内的水分子(Wat166)与第52位残基(Asn52)、第78位残基(Thr78)相连,在Cyt c内部形成了一个复杂的分子网络。有意思的是,Asn52与Thr78、Met80分别所在的两个Ωloop(40-57位残基Ωloop与71-85位残基Ωloop)最近被发现是Cyt c的两个最不稳定的结构单元,在蛋白去折叠的过程中这两个loop会最早的去折叠；71-85位残基Ωloop的折叠及Met80-heme配位的形成也是Cyt c分子完成蛋白折叠的最后一步。与此同时,Cyt c与线粒体膜结合的氨基酸残基(Lys72 or Lys73)也位于71-85位残基Ωloop上。显然,这个氢键网络对于Cyt c的生理功能有着重要意义。为了阐明这个氢键网络的生理意义,我们对酵母细胞色素c第67位残基进行了基因突变,构建了Y67H与Y67R两个突变体蛋白,将Tyr67分别突变为组氨酸与精氨酸,从而破坏Cyt c分子内Tyr67维系的高度保守氢键网络。我们利用UV-Vis、CD、荧光等谱学方法对这两个突变体蛋白进行了表征,发现这两个突变体蛋白随温度的升高很容易发生一种构象变化。当温度升高时,这两个蛋白的二级结构发生显著变化,同时蛋白的整体结构仍保持完整。Y67H突变体构象变化的中点温度(Tm)为50度,Y67R突变体构象变化的Tm为30度。同时,通过对它们构象变化前与变化后的过氧化物酶活性进行动力学测定,发现这种构象变化跟过氧化物酶活性强烈相关。Y67H突变体随构象变化过氧化物酶活性增大了10倍以上,Y67R突变体随构象变化过氧化物酶活性增大了50倍以上。显然,当Cyt c的氢键网络被改变后,会很容易发生一种与过氧化物酶活性密切相关的构象转换。这个发现第一次给出了Cyt c促细胞凋亡构象转换的很可能的机理：当Cyt c通过其71-85位残基Ωloop上的Lys72或Lys73与线粒体膜上的cardiolipin结合时,该loop相连的Cyt c内高度保守氢键网络被破坏,从而带来蛋白的二级结构变化,使得Cyt c表面通道打开,过氧化物酶活性显著升高,引发线粒体膜通透性增加,启动细胞凋亡。另外,我们对人细胞色素c的碱式构象转换的热力学与动力学进行了深入的研究。细胞色素c由于在细胞的生存和死亡中都起着极重要作用,在千万年的进化历程中它变化极小,从酵母细胞色素c到我们人类的细胞色素c并没有发生很大变化。人细胞色素c由于来源困难,一般人们都用采用酵母细胞色素c进行Cyt c的研究。但近年来,人们发现细胞色素c与细胞凋亡以及细胞氧化压力都有着重大关系,而这两个生命过程与目前困扰人类的多种重大疾病,如癌症、艾滋病、帕金森症等都有着直接关联。因此,人细胞色素c对于生物医药领域有着重要的潜在应用价值。我们利用RT-PCR的方法,第一次从人基因组中扩增出了真正的人细胞色素c的cDNA,并且构建了人细胞色素c的表达质粒。进一步通过一系列的条件摸索与优化,建立了一套高效的人细胞色素c的表达、纯化体系,人细胞色素c的蛋白产量可以达到20mg/L培养基。同时我们还对Apaf-1的细胞色素c结合区域进行了克隆,并第一次建立了该区域的原核可溶表达方案,为我们实验室进一步探索Apaf-1和细胞色素c结合的机制奠定了基础。利用人细胞色素c的表达、纯化体系我们制备了大量的人细胞色素c纯蛋白,从而可以对它的性质进行广泛研究。通过对酵母、马心与人细胞色素c的对比研究,我们发现虽然它们的谱学性质基本相同,它们的碱式构象转换存在明显的差异。碱式构象转换是指在碱性条件下,Cyt c的第六位轴向配体会由Met80转变为Lys72或Lys73或Lys79的构象转换。这种构象转换的生理意义目前还不清楚。我们通过热力学表征,发现人Cyt c碱式构象转换的pK。比酵母与马心Cyt c的要高,而动力学表征也显示人Cyt c的碱式构象转换比另两种物种Cyt c的碱式构象转换更困难。分子动力学模拟显示随着酵母到马到人,Cyt c的Lys72、73、79所在的Ωloop越来越远离heme，这很可能是碱式构象转换难度增大的原因。显然,随着生物的进化各物种的Cyt c发生碱式构象转换的阈值逐渐增大。了解推动碱式构象转换难度增加的进化压力到底是什么是非常有意思的,这有待于人们进一步研究。另一方面,这些结果也表明了碱式构象转换具有重要的生物学意义。这也激起了我们进一步对Cyt c的碱式构象转换进行研究的兴趣。Cyt c的碱式构象转换是Cyt c最早被发现的构象变化之一,它的生理功能还不清楚,人们对于这种构象变化的研究集中在它的机理研究上。目前认为,Cyt c的碱式构象转换是先由Cyt c的某“启动基团”去质子化,形成一个中间态,然后再由中间态经历构象的可逆转换,变成为赖氨酸配位的碱式构象状态。目前研究与争议的焦点在于“启动基团”的鉴定,有多个基团都被认为可能是启动基团,其中最有可能的基团是赖氨酸Lys72/73/79、Tyr67或Tyr67所连的水分子。同时,还有人推测去质子化后的中间态可能是Tyr67配位的状态。之前,我们发现了Tyr67的突变体蛋白很容易发生一种类似于促细胞凋亡构象转换的构象变化,因此Tyr67的突变体蛋白是研究碱式构象转换的机理,并且将其与促细胞凋亡构象进行比较的绝佳模板。为此,我们在酵母Cyt c Y67H突变体的基础上进一步构建了Cyt c的Y67H/M80V与Y67H/M80D突变体,对它们的碱式构象转换进行了研究。如果Tyr67是碱式构象转换的启动基团,那么将Tyr67突变为其它氨基酸后,蛋白碱式构象转换的机理必然发生变化。但我们通过对各突变体的碱式构象转换的热力学与动力学进行表征,发现它们的碱式构象转换的机理与野生型Cyt c几乎完全一样。因此,我们的研究结果第一次证明了Tyr67不是Cyt c碱式构象转换的启动基团。另外有意思的是,Y67H与Y67H/M80D突变体的碱式构象转换都要比野生型Cyt c还要困难；Tyr67维系的氢键网络很可能是Cyt c促细胞凋亡构象转换的启动基团,却不是碱式构象转换的启动基团；Tyr67的突变体很容易发生类似促细胞凋亡的构象转换,却很难发生碱式构象转换,这些结果都第一次证明了,Cyt c的促细胞凋亡构象转换与其碱式构象转换采用了完全不同的机理。另外我们还发现,随着pH的增加Tyr67的突变体的过氧化物酶活性反而显著减小。这些结果第一次表明了Cyt c的这种可逆的碱式构象转换,在细胞内很可能是作为一种抵御非正常细胞凋亡的防御机制。Cyt c表面的赖氨酸与线粒体膜结合发生不可逆的促细胞凋亡构象转换,过氧化物酶活性显著增高导致细胞凋亡的发生；而Cyt c也可能作出另外一种反应,表面的赖氨酸去质子化启动可逆的碱式构象转换,造成赖氨酸收缩到Cyt c内部与heme配位而无法与线粒体膜结合,同时蛋白的过氧化物酶活性降低,从而抵御细胞凋亡途径。这个发现揭示了细胞色素c的碱式构象转换具有极重要的生理意义。本论文的另外一部分工作是构建一类新颖的血红素金属蛋白嵌合体。蛋白质工程的终极目标之一就是设计出兼具稳定与催化活性的新蛋白酶,从而将其应用在化工或制药等工业领域。金属蛋白由于有金属离子或金属辅基的帮助,具有功能高效性与多样性等特点,特别适合蛋白质工程改造。其中血红素蛋白家族尤为突出,不同的血红素蛋白利用血红素辅基和蛋白肽链的不同构架,在自然界中呈现出许多不同的结构与功能。因此,我们试图通过蛋白质工程将两种不同的血红素金属蛋白杂合,希望构建出一类新颖的同时具有高稳定性、高催化活性的蛋白嵌合体,甚至能够执行自然界没有的新奇的催化反应。首先由于细胞色素c结构与性质都非常稳定,我们将其选为嵌合体的主体结构单元。我们选取的另一种血红素金属蛋白为细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450),这类蛋白可以催化几百种不同的底物,执行环氧化、羟基化等不同的催化反应。我们通过重叠延伸PCR的方法,将CYP450用来识别底物的底物识别位点区域(substrate recognition sites, SRS) SRS-1、SRS-2、SRS-3、SRS-5、SRS-6的基因序列分别构建到Cyt c的基因中,取代Cyt c中最不稳定的78-85 loop。通过表达与纯化的摸索,成功得到了这五种嵌合体蛋白酶的纯蛋白,分别命名为HY1、HY2、HY3、HY5与HY6。接着我们使用UV-Vis、CD、荧光等谱学方法对这五种嵌合体的稳定性进行了表征,发现这五种嵌合体都获得了非常高的稳定性。进一步,我们使用CYP450的经典底物之一苯乙烯来鉴别嵌合体蛋白酶是否获得了CYP450的催化活性。通过GC-MS表征发现虽然野生型Cytc、HY2、HY3与HY5都不能将苯乙烯氧化,但HY1与HY6可以将苯乙烯环氧化生成氧化苯乙烯,即这两个嵌合体具有的CYP450的催化活性。另外,通过对HY1与HY6的过氧化物酶活性的测定,发现HY6的过氧化物酶活性比野生型Cyt c增大了10倍,而HY1的过氧化物酶活性比野生型Cyt c增大了超过40倍。这些数据表明,我们成功的构建了一些新颖的血红素金属蛋白嵌合体,使其同时具有了优越的稳定性与高的催化活性。我们实验室目前正在对这些嵌合体蛋白进行蛋白质晶体学尝试,希望获得嵌合体蛋白的结构从而更好的理解它们的催化机理,以利于我们进一步的设计构建。