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高同型半胱氨酸血症(Hypohomocysteinemia,HHcy)是动脉粥样硬化独立的危险因素。研究显示同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)不仅通过调节周期蛋白A、抵抗素、蛋白酶C及胞外信号调节激酶-丝裂原活化蛋白激酶等途径激活平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC),还可能通过血管内皮细胞(endothelial cell,EC)依赖性途径激活VSMC,但其机制尚不清楚。血小板衍生因子(Platelet-derived growth factors,PDGFs)是VSMC增殖与迁移的强刺激因子。PDGFs可通过自分泌及旁分泌方式调节包括动脉粥样硬化、血管重朔、纤维化与血管再生等多种疾病的病理生理过程。研究显示Hcy可增加PDGF-BB对VSMC的促迁移作用。然而,Hcy对EC中PDGFs调节作用乃至EC与VSMC间的相互作用关系仍不明确。因此,本研究通过体内及体外实验研究Hcy是否通过上调EC中PDGFs进而调节VSMC的增殖与迁移。 首先,我们采用不同浓度Hcy对单纯培养及与EC共培养的VSMC进行刺激,发现以500μMHcy刺激VSMC24小时才能增加VSMC的增殖与迁移,而当EC与VSMC共培养时,在100μM浓度时就能明显增加VSMC的增殖和迁移,且这种作用能明显被PDGFs受体拮抗剂所阻滞。同时实时定量PCR及ELISA方法显示,Hcy能以浓度依赖性上调EC中PDGF-A、-C和-D的mRNA及蛋白水平,而不影响其它生长因子如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-2、转化生长因子-β1的表达。说明Hcy通过PDGFs介导EC-VSMC之间的相互作用。为研究Hcy对PDGFs的调控机制,我们采用生物信息学分析发现PDGFs启动子区存在丰富CpG岛,并在其中发现转录因子SP-1特异性结合位点。进一步实验研究显示Hcy及甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR和3-DZA均可使EC中PDGF-A、-C和-D启动子DNA甲基化水平下降,增加转录因子SP-1对该启动子区结合活性,使PDGF-A、-C和-D表达升高;而用RNA干扰技术(siRNA)降低SP-1表达可减少EC中PDGF-A、-C及-D的表达及VSMC的迁移及增殖。同时我们发现Hcy减少EC中DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的表达和活性,而且用siRNA干扰DMNT1表达能增加PDGF-A、-C和-D水平。说明Hcy通过抑制EC中DNMT1表达使DNA低甲基化及SP-1与启动子结合活性增加,引起PDGFs表达上调及分泌增加,进而激活VSMC。 为验证细胞实验的结果,我们分别用高蛋氨酸(2％)喂养C57BL/6J小鼠4周或8周建立轻度和中度HHcy动物模型,其血清Hcy水平分别为27.6和61.5μmol/L,显著高于正常饮食对照组(5.2μmol/L)。甲基化特异性PCR结果显示小鼠胸主动脉内膜中PDGF-A、-C和-D基因启动子区DNA甲基化水平分别由86.0%、78.2%和73.2%下降到52.2%、36.7%和33.0%,而它们的mRNA及蛋白表达明显升高。同时,免疫荧光染色显示,HHcy小鼠胸主动脉VSMC增殖标志物增殖细胞核抗原(PCNA)及EC激活标志物血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)和细胞间粘附因子-1(ICAM-1)表达明显增高。临床研究显示,临床患者血清中Hcy水平与PDGFs水平呈正相关。 结论:Hcy通过抑制血管EC中DNMT1的表达降低PDGFs基因DNA甲基化水平,促进SP-1与PDGFs启动子区的结合并增加PDGFs的表达及分泌,进而导致VSMC的激活。