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目的本课题采用TGF-β1诱导宫颈癌细胞(CaSki与HeLa 299),构建上皮-间质转化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT)体外模型,研究橙皮素(hesperetin,HES)对EMT引起的宫颈癌细胞侵袭转移的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法1.观察橙皮素对EMT引起的宫颈癌细胞侵袭转移的抑制作用采用浓度为10ng/mL的TGF-β1诱导宫颈癌CaSki、HeLa 299细胞,建立EMT体外模型。设置对照组(Control)、模型组(10ng/mL TGF-β1)、TGF-β1及不同浓度橙皮素干预组(10ng/mL TGF-β1+HES10?M/L;10ng/mL TGF-β1+HES 20?M/L)。(1)MTT法检测A.不同浓度橙皮素干预24、48及72h后,宫颈癌细胞存活率;B.橙皮素对TGF-β1干预下宫颈癌细胞存活率的影响;(2)细胞形态学观察A.10ng/mL的TGF-β1作用不同时间后,宫颈癌细胞形态的变化;B.橙皮素对TGF-β1诱导的宫颈癌细胞EMT形态改变的影响;(3)划痕实验和transwell迁移实验观察橙皮素对TGF-β1诱导的宫颈癌细胞迁移能力的影响;(4)transwell侵袭实验观察橙皮素对TGF-β1诱导的宫颈癌细胞侵袭能力的影响。2.探讨橙皮素对EMT引起的宫颈癌细胞侵袭转移的抑制作用与TGF-β1/Smad信号通路之间的关系如方法1建立EMT模型,设置分组。(1)免疫荧光法检测宫颈癌细胞胞浆内E-cadherin、N-cadherin的荧光强度;(2)Western blot实验检测蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist2、ZEB、Laminin R、Fibronectin 1、MMP2、MMP9、Galectin 1、Pard 6A、Pard 3、?PKC、TGF-βReceptor II、TGF-βReceptor I、P-TGF-βReceptor I、P-Smad2/3、Smad4的表达水平。结果1.(1)A.与各时间段对照组相比,不同浓度橙皮素干预CaSki和HeLa 299细胞后均显著抑制细胞存活率(P<0.05)。B.与各时间段对照组相比,10ng/mL的TGF-β1作用后,两株细胞的存活率均升高(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素处理后两株细胞的存活率呈时间剂量依赖性显著降低(P<0.01)。(2)A.10ng/mL的TGF-β1处理两株细胞后,细胞形态依时间依赖性呈间质样改变。B.与对照组相比,模型组两株细胞形态呈间质样,而橙皮素干预后,随着药物浓度增加,细胞形态逐渐转变回上皮样。(3)A.与对照组相比,48h模型组两株细胞愈合能力显著增强(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞愈合能力按照剂量依赖性显著下降(P<0.01,P<0.05)。B.与对照组相比,模型组两株细胞转移数目显著增加(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞转移数目依剂量依赖性下降(P<0.05,P<0.01)。(4)与对照组相比,模型组两株细胞侵袭数目显著增加(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞侵袭数目按照剂量依赖性显著下降(P<0.001,P<0.001)。2.(1)与对照组相比,模型组两株细胞E-cadherin的荧光强度降低,N-cadherin的荧光强度升高。与模型组相比,橙皮素干预后,两因子的荧光表达发生逆转;(2)A.与对照组相比,模型组两株细胞E-cadherin的蛋白表达水平降低(P<0.05),N-cadherin的表达水平升高(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞E-cadherin的表达水平升高(P<0.05),N-cadherin的表达水平降低(P<0.05)。B.与对照组相比,模型组两株细胞Snail、Twist2、ZEB的蛋白表达水平均升高(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞上述蛋白的表达水平均不同程度显著降低(P<0.01)。C.与对照组相比,模型组两株细胞Laminin R、Fibronectin1、Galectin 1、MMP2、MMP9的蛋白表达水平均升高(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞上述蛋白的表达均不同程度显著降低(P<0.01)。D.与对照组相比,模型组CaSki细胞Pard 3的蛋白表达水平升高(P<0.05);模型组HeLa 299细胞Pard 6A、Pard 3、?PKC的蛋白表达均未改变。而与模型组相比,20?M/L橙皮素干预后,CaSki细胞Pard 3的表达降低(P<0.05)。E.与对照组相比,模型组两株细胞TGF-βReceptor II、P-TGF-βReceptor I的蛋白表达水平均升高(P<0.05);TGF-βReceptor I、细胞核和胞浆中的P-Smad2/3、细胞核和胞浆中的Smad4的表达水平均降低(P<0.05)。而与模型组相比,橙皮素干预后,两株细胞上述蛋白的表达均发生不同程度的逆转(P<0.01)。结论1.橙皮素可以干预TGF-β1诱导的EMT过程,抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭作用;2.橙皮素通过调控TGF-β1/Smad信号通路干预EMT过程抑制宫颈癌细胞侵袭转移。