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上皮细胞恶性转化为鳞癌的机制是近几十年来的研究热点,其中上皮细胞的增生与凋亡理论得到了广泛认可,并得到相应的一系列实验研究的证实。以往研究证实上皮细胞作为体细胞其恶性转化过程是由其所处的细胞微环境诱导产生,那么在细胞微环境中是否存在某一个或数个影响上皮-肿瘤性变过程的关键位点呢?通过实验筛选的方法,找到上皮恶性转变过程中的关键作用位点,将为预防和阻断癌变指明方向。本实验选取在细胞微环境中作用极为关键的钾离子通道Kv3.4的变化做研究对象,采用免疫组织化学染色和逆转录酶链式反应进行验证研究,为口腔颌面部鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的后续研究和临床治疗提供理论数据和治疗参考。 目的:1.检测癌变过程中上皮细胞离子通道Kv3.4蛋白含量的变化及通道基因Kv3.4 mRNA的变化规律;2.探讨细胞离子通道 Kv3.4与口腔鳞癌发生发展的关系。 方法:1.Sprague-Dawley(SD)大鼠口腔黏膜上皮细胞体内癌变模型的建立:58只SD大鼠,随机选取48只为实验组,10只为对照组,4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4NQO)溶液(40ppm)给实验组SD大鼠饮用诱导其发生持续癌变过程;2.SD大鼠癌变模型的鉴定:取得模型大鼠口腔黏膜上皮组织后立即固定包埋,切片 HE染色,专业病理医师对切片进行病理诊断,鉴定持续癌变过程模型的建立是否成功;3.Kv3.4蛋白检测:组织连续切片进行SP法免疫组织化学染色(Immunohistochemistry, IHC),测定Kv3.4蛋白表达含量,抗体浓度为1:400,Kv3.4表达差异的检测结果采用非参数检验的多样本秩和检验( Kruskal-Wallis Test)和两样本秩和检验( Mann-Whitney Test)进行分析,检验水准α=0.01;4.冰冻组织提取总 RNA后逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测mRNA含量的变化,数据分析采用电泳凝胶用Bio-Rad凝胶摄像系统采集各标本灰度值,Quantity one4.4分析数据。统计使用T检验,检验水准α=0.05,分析各组 mRNA表达关系。数据处理采用SPSS19.0(windows XP)完成。 结果:1.HE染色结果:正常组织16例,轻度异常增生10例,中度异常增生12例,重度异常增生(原位癌)11例,口腔鳞癌9例。镜下观:异常增生可见上皮细胞层次紊乱,极性消失,上皮钉突呈滴状,有丝分裂相增加,细胞核浓染增大,棘层细胞有角化现象,符合组织病理学特点。2.Kv3.4蛋白检测结果:在细胞浆和细胞膜有Kv3.4的表达,细胞核偶有表达,腺体和血管内皮可见阳性表达,细胞间质未见表达。Kv3.4蛋白的表达随上皮异常增生程度增加而增高,在口腔鳞癌中呈现强阳性。统计学分析(Mann-Whitney Test)正常口腔黏膜组织与上皮异常增生和口腔鳞癌中Kv3.4的表达,差异均有统计学意义(P<0.01)且Kv3.4表达阳性率呈上升趋势;在轻中重度异常增生之间未见统计学差异(P>0.01);经X2趋势检验在正常口腔黏膜、上皮异常增生、口腔鳞癌三组间Kv3.4蛋白呈现逐渐升高的趋势。3.RT-PCR检测mRNA含量变化:凝胶分析软件采集电泳凝胶数据,经统计学分析(T检验),Kv3.4 mRNA在各组含量变化为:从正常口腔黏膜组到上皮异常增生组再到口腔鳞癌组,Kv3.4 mRNA含量有逐渐增高的趋势。正常口腔黏膜组与上皮异常增生组间差异有统计学意义(P<0.05),正常口腔黏膜组与口腔鳞癌组间差异有统计学意义(P<0.001, P<0.05);上皮异常增生组与口腔鳞癌组间差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05);上皮异常增生组间差异无统计学意义(P>0.05)但有逐渐增高的趋势。 结论:1.Kv3.4蛋白含量随上皮异常增生程度增加而升高;2.Kv3.4 mRNA含量因上皮异常增生到口腔鳞癌组织变化过程中有不同程度升高。