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目的:研究survivin、c-Myc蛋白在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, Rb)组织中的表达,探讨Rb中survivin与c-Myc蛋白的表达及与瘤细胞凋亡的关系;体外观察曲古菌素A(trichostatin A,TSA)诱导人Rb细胞株Hxo-rb44的细胞周期阻滞和凋亡的作用,以及TSA对凋亡抑制蛋白survivin和原癌基因c-Myc表达变化的影响;构建针对survivin蛋白的shRNA(short hairpin RNA,短发夹RNA)表达质粒,观察其对人Rb细胞株Hxo-rb44细胞的survivin及c-Myc蛋白表达的抑制作用,以及对细胞凋亡的影响,为探讨shRNA-survivin应用于Rb的基因治疗提供理论基础。方法:(1)华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科1994年12月至2005年8月期间的接受眼球摘除术的Rb病人23例23只眼,用免疫组织化学的Sp法(streptavidin-peroxidase conjunct method,链霉亲和素-过氧化物酶连接法)检测survivin、c-Myc蛋白在这23例Rb组织中的表达;用TUNEL技术(terminal deoxynucleo -tidyl transferase-mediate deoxyuridinetriphosphate nick end labeling, TdT-mediated d-UTP nick end labeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术)检测Rb组织中的瘤细胞凋亡情况。(2)对人Rb细胞株Hxo-rb44进行培养传代,用流式细胞仪检测不同浓度的TSA作用不同时间后对Hxo-rb44细胞株之细胞周期和细胞凋亡的影响,用Western blot(蛋白质免疫印迹)法检测凋亡过程中survivin和c-Myc蛋白表达的动态变化。(3)设计合成一对针对人survivin的mRNA寡核苷酸序列,退火后将其连入载体,对重组质粒pSIREN进行酶切鉴定;用脂质体介导的方法将干扰质粒pSIREN转染Hxo-rb44细胞,用Western blot法检测转染对survivin、c-Myc蛋白表达的影响,用Hoechst33258染色法检测转染前后的Hxo-rb44细胞诱导凋亡率,并绘制出细胞生长曲线。结果:(1)在23例23只眼Rb组织切片中,survivin蛋白阳性表达率为60.9%(14/23),可见阳性部位位于胞浆;c-Myc蛋白阳性表达率为73.9%(17/23),可见阳性部位位于胞核。平均凋亡指数(apoptosis index, AI)为0.52%。survivin蛋白表达与Rb瘤细胞凋亡指数明显呈负相关关系,与c-Myc蛋白表达呈正相关关系(p<0.05)。(2)TSA可明显诱导Rb细胞周期阻滞在G2期并诱导凋亡的发生,而且与药物浓度呈依赖关系;用Western blot法可以观察到survivin和c-Myc蛋白表达水平随着TSA作用时间的延长而显著下降。(3)酶切证实目的寡核苷酸片段已经被克隆到pSIREN,转染pSIREN质粒可以显著抑制瘤细胞的survivin蛋白表达;细胞凋亡率由3.5±1.29%上升到36.1±19.66%,c-Myc蛋白表达也显著下降,瘤细胞生长受抑制。转染对照质粒对细胞survivin、c-Myc蛋白及凋亡均无明显影响。结论:(1)survivin和c-Myc蛋白在Rb协同高表达的现象,可能在Rb的发生发展过程中发挥抗凋亡促增殖的重要作用。(2)TSA可以有效诱导人Rb细胞株Hxo-rb44的细胞周期阻滞和细胞凋亡,其作用机制与抑制survivin和c-Myc蛋白表达有关。(3)成功构建了人survivin基因的短发夹RNA表达质粒,其对Rb的survivin蛋白表达有显著抑制作用,并伴有瘤细胞凋亡率的增加。提示survivin蛋白表达受抑制及同时引起的c-Myc蛋白表达受抑制可能参与了其导致瘤细胞凋亡的机制。