粘细菌具有复杂的社会学行为,不利环境下可产生多细胞子实体和抗逆性粘孢子应对,是研究原核生物进化和信号调控的重要模式生物；粘细菌代谢产生的次级产物种类多样、结构和机制新颖、应用广泛,因而粘细菌一直是备受各方关注的研究重点。然而其滞后的遗传操作体系一直阻碍着粘细菌的研究和应用。本实验室于2006年与中国科学院植物生理生态研究所合作发现了自主复制质粒pMF1,基于pMF1特殊的复制区构建了Escherichio coli-M. xanthus穿梭载体pZJY41和pZJY156,为粘细菌遗传学深入研究提供了有利条件。在粘球菌DZ1电转入pZJY41,提取复制中间体通过探针杂交法发现其不产生单链DNA,证明了自主复制质粒pMF1采用theta型机制进行复制,并证明了pZJY41中包含的pMF1.13和pMF1.14基因,后者是编码复制起始蛋白,前者功能未知。但pMF1.14并不包含DNA结合基序等常见复制起始蛋白包含的功能区域,而且质粒测序结果推测pMF1.13到pMF1.16四个基因很可能处于同一个操纵子中,这与常见复制起始调控模型也很不相符,这使我们更加有理由认为pMF1的复制起始调控区域是特殊的,很可能是多个连续基因共同行使调控复制起始的功能,这种特殊性的内在原因对于pMF1、对于Myxococcus fulvus124B02乃至粘细菌遗传进化都可能有特殊的意义。本论文主要针对复制起始区域的pMF1.13和pMF1.14基因展开实验工作。首先,常见的theta复制模型中复制起始蛋白会结合复制区中称为重复子的正向重复序列,在复制区富含AT的区域解开双链进而复制起始。而pMF1.14编码的蛋白预测并没有DNA结合区域,但是在最小顺式作用区12894～13263中含有密集的DNA重复序列,推测pMF1中复制起始蛋白与DNA作用后起始复制的方式较为特殊。尝试通过大肠杆菌异源表达复制起始蛋白pMF1.14。该蛋白理论等电点为9.85,为碱性蛋白,在GenBank数据库中搜索不到同源蛋白,尝试表达了带有组氨酸标签的全长蛋白,蛋白表达多为包涵体,纯化效果不理想；用GST助溶标签和pCold TF助溶体系表达目的蛋白,有可溶型表达,但其可溶型组分与亲和层析柱结合不理想；尝试柱上酶切方法,得到较为纯净的目的蛋白。体外验证pMF1.14是否有DNA结合活性,由于样品不够纯净且浓度较低未得到明显阻滞结果。生物信息学显示复制区附近的四个基因共转录,可能共同行使复制起始调控功能。通过反转录实验得到了四个基因共转录的证据,即pMF1.13~pMF1.16四个基因在同一个操纵子上,那么它们很可能行使同样的功能,那么四个基因在质粒复制起始中扮演什么角色呢?穿梭载体pZJY41比pZJY156多一个完整的pMF1.13基因,同时拷贝数和稳定性都要强于后者。另外,通过qPCR等实验,我们发现pMF1.13基因存在情况下能有效提高pMF1.14的转录水平,这说明pMF1.13很可能起正调控因子的作用。调控因子的方式有很多种,可能是通过结合DNA影响启动子活性,也可能是通过和相关酶结合形成复合体影响基因的转录水平。为深入研究pMF1.13的功能,证明其是否通过结合DNA行使功能,我们需要将该蛋白纯化出来。尝试异源表达的多种纯化方式,但由于pMF1.13蛋白的理化性质,在纯化工作上遇到很多问题。用pCold TF助溶体系表达目的蛋白,有可溶型表达,但酶切后目的蛋白沉淀,无法直接进行纯化和体外实验。后来我们用带标签的重组蛋白进行了DNA结合实验和DNA pull-down实验等体外实验的尝试,有一定的阳性结果。根据结果进一步研究pMF1.13的作用方式。