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目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种由多因素诱导的,以大中动脉血管为主的慢性炎症反应疾病,严重影响着人们的身体健康及生活质量,已成为心血管疾病发病的主要诱因。通道蛋白作为维持细胞正常生命活动的重要元素,与AS的发生发展密切相关。Pannexins(Panx)蛋白家族是一种膜通道蛋白,其中Pannexin-1蛋白为该通道蛋白在组织和细胞中的主要表达形式。研究认为Pannexin-1寡聚体可以形成膜通道,当通道开放时可允许分子量小于1kDa的离子或分子通过,包括腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)等一些小分子物质。ATP作为一种重要的细胞信号分子,同样在调节动脉粥样硬化形成和发展过程中起着至关重要的作用,如促进巨噬细胞释放炎性细胞因子、调节巨噬细胞对脂类物质的转运,影响泡沫细胞形成等过程。然而,由Pannexin-1蛋白寡聚体组成的膜通道,能否调控脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞释放ATP尚未见报道。因此,本课题目的在于研究Pannexin-1通道能否作为LPS诱导巨噬细胞释放ATP的途径,并且初步探讨Pannexin-1通道对巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)的调节作用,为预防和治疗动脉粥样硬化疾病开拓新思路提供新靶点。 方法: 1.采用佛波酯(Phorbol12-myristate13-acetate,PMA)诱导分化THP-1使其成为THP-1源性巨噬细胞,并经细胞形态学及CD14 mRNA的表达情况对巨噬细胞进行鉴定。 2.采用RT-PCR和qPCR技术检测THP-1细胞中Pannexin-1 mRNA的表达水平,并进一步分析细胞诱导前后以及LPS刺激对Pannexin-1 mRNA表达变化的影响。 3.采用萤光素酶法检测LPS刺激和应用Pannexin-1通道抑制剂后细胞释放ATP含量的变化。 4.采用荧光显微镜拍摄巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL后的荧光图片,并使用图像分析软件(Image-pro plus v6.0)对荧光图片进行分析,计算出对应图片的平均荧光强度,用以衡量细胞摄取Dil-ox-LDL量的变化情况。 结果: 1.THP-1细胞经160nM PMA诱导分化24小时后,细胞形态由分化前的圆形,悬浮生长,变为梭型或长梭型,并有大量的伪足出现,呈贴壁生长;基因水平检测结果显示,THP-1经诱导分化为THP-1源性巨噬细胞后,THP-1源性巨噬细胞中CDI4 mRNA表达水平明显上调,与THP-1细胞相比有显著性差异(**P<0.01);RT-PCR和qPCR结果显示,在THP-1细胞中Pannexin-1 mRNA表达丰富,细胞经PMA诱导分化后,THP-1源性巨噬细胞中的Pannexin-1 mRNA表达量较对照组明显增加(**P<0.01),并且THP-1源性巨噬细胞经1μg/mL LPS刺激4小时后,Pannexin-1 mRNA表达水平较未刺激组显著升高,差异有统计学意义(##P<0.01)。 2.THP-1源性巨噬细胞经1μg/mL LPS刺激不同时间(0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min)后,LPS刺激组各时间点细胞释放的ATP含量较对照组显著增加(**P<0.01),并且LPS刺激5分钟时达到高峰;当使用Pannexin-1通道抑制剂生胃酮(CBX;100μM)预处理细胞30分钟后,再用LPS刺激细胞5分钟,检测细胞释放ATP含量变化情况。结果显示,使用CBX后细胞释放ATP的含量较LPS刺激组明显减少(**P<0.01);同样,以Pannexin-1通道特异性抑制(10Panx1;200μM)预处理细胞30分钟,检测结果显示10Panx1明显的抑制了由LPS诱导的ATP释放效应,ATP释放量较LPS刺激组明显下降,差异有统计学意义(##P<0.01)。 3.巨噬细胞吞噬实验结果显示,1μg/mL LPS刺激THP-1源性巨噬细胞4小时后,能够明显的促进细胞对Dil-ox-LDL的摄取,较对照组相比具有显著性差异(**P<0.01);当预先以Pannexin-1通道抑制剂CBX(100μM)或10Panx1(200μM)预处理细胞30分钟,再用LPS刺激细胞4小时,结果发现抑制剂组可以减弱细胞对Dil-ox-LDL的摄取,与LPS刺激组相比有显著性差异(##P<0.05)。 结论: 1.Pannexin-1通道可调节LPS诱导THP-1源性巨噬细胞释放ATP的过程; 2.Pannexin-1通道对LPS诱导巨噬细胞摄取ox-LDL的能力起到调节作用。