论文部分内容阅读
目的本课题主要是探讨：1、从人脐带中分离出间充质干细胞并且能进行稳定的体外传代培养的方法；2、直接局部移植人脐带间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的疗效；3、经静脉移植人脐带间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的疗效及间充质干细胞迁移到SCI部位的情况；4、直接局部移植、静脉移植两种途径移植hUC-MSCs修复脊髓损伤的疗效对比观察；5、hUC-MSCS修复脊髓损伤的可能机制，为临床治疗急性脊髓损伤寻找一种合适的移植方式。材料和方法1、人脐带间充质干细胞的原代培养、传代与鉴定：取足月妊娠、健康顺产的胎儿脐带，利用组织块贴壁法原代培养脐带间充质干细胞。一般培养5-6天在倒置显微镜下即可见到少量新生的细胞，12-15天时以组织块为中心周围可见细胞明显增多，大体呈漩涡状或放射状分布，细胞形态细瘦，类似成纤维样细胞。传代后的hUC-MSCs生长迅速，可以得到大量的脐带间充质干细胞。利用流式细胞仪进行鉴定，待细胞传到第5代后用Brdu体外标记，避光生长三天后消化细胞成细胞悬液准备移植。2、脊髓损伤打击模型的制备、分组与移植治疗：80只清洁级wistar大鼠，雌雄不限，体重200-220g，建立大鼠脊髓损伤模型后随机分为5组：空白对照组(A组，10只)、DMEM局部移植组(B组，15只)、DMEM静脉移植组(C组，15只)、细胞局部移植组(D组，20只)、细胞静脉移植组(E组，20只)。A组只做损伤，不做任何移植作为空白对照组；B、C两组大鼠分别通过局部、静脉移植与细胞等量体积的DMEM；D、E两组大鼠分别通过局部和静脉途径移植人脐带间充质干细胞的细胞悬液。3、脊髓损伤功能恢复的评价:术后通过第1天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周和12周动物模型的BBB评分来观察大鼠后肢功能恢复的情况。术后定期随机取大鼠脊髓标本，先行大体形态学观察，再行HE染色和嗜银染色，观察脊髓损伤周围空洞形成情况以及神经轴突的再生情况。免疫荧光观察hUC-MSCS在损伤局部存活、迁移、分化情况；通过免疫组化染色技术来检测胶质纤维酸性蛋白(GFAp)的多少，比较各组损伤局部胶质瘫痕形成面积的大小。结果BBB评分：D、E组于损伤后3周评分分别达7.20士0.70,7.12士0.81，明显高于A、B、C等其他各组，差异有统计学意义(p<0.05)，而其D、E组组间差异没有统计学意义(p>0.05)，A、B、C组组间差异没有统计学意义(p>0.05)。术后1d、1、2周各组结果之间没有显著性差异（P＞0.05）；术后4周、6周、8周、10周、12周，D、E组均与ABC组存在显著性差异（P﹤0.05），D、E组组间差异没有统计学意义(p>0.05)，A组、B组、C组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。HE染色和嗜银染色见D组、E组均有较多的再生轴突，部分再生神经纤维通过损伤区，D、E组再生轴突的数量无明显差异；而A组、B组和C组仅有极少散在的再生轴突，无连续性的神经纤维通过脊髓损伤区。免疫组织化学染色显示hUC-MSCs移植入大鼠体内后可在损伤局部存活并向损伤局部迁移；但是并没有检测到向神经元、星形胶质细胞分化；损伤后3周，E组大鼠损伤局部即可见hUC-MSCs，并且损伤后12周局部仍可见少量的移植细胞。免疫荧光检测见D组、E组损伤周围星形胶质细胞的形态趋于正常，不仅排列规则，而且大量星形胶质细胞通过损伤区，两组形成的胶质瘫痕面积较A组、B组、C组减少。结论1、利用组织块贴壁法可成功的从人脐带中分离培养出间充质干细胞并进行细胞的传代扩增及鉴定。2、直接局部移植hUC-MSCs后能够有效的促进大鼠脊髓损伤神经功能的恢复。3、静脉移植hUC-MSCs可到达损伤的脊髓局部并产生修复受损的大鼠脊髓组织的作用。4、通过静脉途径移植hUC-MSC的疗效相似于直接局部移植修复脊髓损伤的疗效。