第一部分肝细胞性肝癌患者HGF/c-Met表达特征评价目的：检测原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者血清肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)水平及HCC组织c-Met蛋白表达水平。方法：通过双抗体夹心酶联免疫ELISA方法检测血清标本中HGF水平,通过免疫组织化学方法检测肝脏病理标本c-Met蛋白染色强度。对肝癌组与肝硬化组及健康人群组在HGF水平、c-Met染色强度等变量进行One-Way ANOVA统计分析和Friedman非非参数检验,评价肝癌组与其他两组间是否存在显著性差异。结果：血清HGF浓度在肝癌组、肝硬化组和正常对照组分别为0.609±0.134ng/ml、0.378±0.116ng/ml、0.271±0.083ng/ml,肝癌组患者血清HGF水平明显高于肝硬化组和正常对照组,差异具有显著性(P<0.01)。不同体积的肿瘤之间血清HGF水平存在显著性差异(P<0.05),肿瘤体积越大则血清HGF水平越高。c-Met蛋白在HCC组织上呈阳性表达,c-Met阳性染色主要定位于肿瘤细胞的胞膜和胞质,而在癌旁组织及正常组织呈弱阳性和低表达,差异具有显著性意义,P<0.01。HCC组织c-Met阳性表达强度与肿瘤分化程度等密切相关,(P<0.05)。结论：1.HCC患者血清HGF水平较肝硬化及正常对照组明显升高,差异具有显著性。2. HCC患者术前血清HGF水平与肿瘤大小有明显正相关性,肿瘤体积越大则血清HGF水平越高。3.c-Met蛋白在HCC组织中表达强度明显高于癌旁组织及正常肝组织,差异具有显著性意义。4. c-Met表达异常与HCC病理分化程度等密切相关。第二部分c-Met过表达细胞株构建及索拉非尼耐药特征观察目的：评价c-Met过表达导致的细胞信号传导异常对索拉非尼抑制肝癌细胞增殖的影响并寻找相应治疗对策。方法：首先通过慢病毒载体将c-Met基因转染至HepG2细胞,并使HepG2细胞能够稳定表达c-Met蛋白,通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株HepG2-met。通过MTT比色法法及AnnexinV-FITC和PI双染法检测细胞周期及凋亡的方法,评价索拉非尼对HepG2细胞/HepG2-met细胞增殖影响是否存在差异,确定c-Met蛋白表达异常升高对索拉非尼抵抗作用。通过Western Blot方法检测(?) c-Met蛋白及其下游mTOR信号蛋白P70S6K、4E-BP1磷酸化水平在HepG2细胞(?)HepG2=met细胞之间的差异,寻找c-Met蛋白表达异常升高对索拉非尼抵抗作用的分子机制。在此基础上通过联合mTOR抑制药物雷帕霉素逆转索拉非尼耐药现象。结果：通过RT-PCR检测慢病毒感染的HepG2细胞中c-Met mRNA确定慢病毒转染MOI=20为最佳MOI值,通过2.5ug/ml嘌呤霉素持续作用10天筛选出抗嘌呤霉素的稳定细胞株HepG2-met。 Westem blot方法分析c-Met的表达和磷酸化及mTOR信号途径中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化改变,显示HepG2-met细胞在c-Met的表达和磷酸化及P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平上均明显超过HepG2细胞。通过细胞生长曲线检测发现HepG2-met具有较HepG2更为活跃的细胞增殖能力。MTT法检测HepG2/HepG2-met细胞对索拉非尼增殖抑制敏感性：索拉非尼对HepG2/HepG2-met细胞增殖抑制作用随着药物浓度的增加而逐渐增加,表现出剂量依赖性；HepG2-met具有一定的索拉非尼药物作用抵抗特征。通过流式细胞术检测可以看出HepG2-met细胞处于S期的比例为65.5%,较HepG2细胞的39.92%明显升高,提示HepG2-met增殖更为活跃,在应用相同剂量的索拉非尼作用后HepG2-met细胞S期比例降至41.07%,细胞凋亡率为35.48%；HepG2细胞的S期比例降至25.89%,细胞凋亡率为63.42%,两组间比较仍有显著性差异,提示索拉非尼对HepG2-met细胞增殖抑制作用有所下降,HepG2-met表现出对索拉非尼一定的耐药性。当HepG2-met组联合应用索拉非尼及小剂量的雷帕霉素后,S期比例降至32.03%,细胞凋亡率上升至65.01%,提示雷帕霉素可以部分逆转HepG2-met细胞高表达c-Met造成的对索拉非尼一定耐药性。结论：1.通过慢病毒转染方式成功构建出c-Met过表达的HepG2-met细胞株,c-Met表达水平较HepG2明显升高。2. HepG2-met细胞株c-Met的表达和磷酸化水平升高,同时其下游信号如mTOR信号途径中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化较HepG2明显升高。3. HepG2-met细胞株具有较HepG2更为活跃的细胞增殖能力。4. HepG2-met具有一定的索拉非尼药物作用抵抗特征。5.雷帕霉素通过抑制1mTOR信号途径中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化可以部分逆转HepG2-met对索拉非尼的耐药作用。第三部分裸鼠荷人肝癌皮下模型的建立目的：通过临床肝癌标本建立裸鼠异种肝癌模型并对肝癌中HBV状态作初步检测。方法：采集肝移植患者肝癌病理组织,种植于裸鼠皮下,经过多次传代生长后,获得可以稳定生长与传代的肝癌裸鼠模型。通过HE染色比较原代肝癌病例组织结构与多次传代后的移植性肝癌模型的病理结果,评价异种肝癌模型是否具有与原代相似的病理组织学特征。同时通过PCR方法检测与HBV相关性肝癌的动物模型中HBV DNA存在状态,初步探讨HBV与HCC相关关系。结果：成功建立4例肝癌动物模型。异种移植肿瘤标本和病人原发肿瘤标本的病理学形态相似,保留了原发肿瘤的部分组织形态学特性。4例肝癌异种移植物模型肿瘤标本分别进行HBV DNA的S区、C区和X区三个独立区域检测,结果一例标本S区、C区和X区均呈阳性,一例标本S区和X区呈阳性,一例标本S区和C区呈阳性。结论：1.通过裸鼠皮下种植肝癌组织成功建立4例肝癌动物模型。2.异种移植肿瘤标本和病人原发肿瘤标本的病理学形态相似,保留了原发肿瘤的部分组织形态学特性。3.部分肝癌模型标本中存在HBV DNA,可能是重要的致癌因素。