延胡索内生真菌的分离鉴定及产功能酶、解磷菌株初探

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延胡索(Corydalis yanhusuo)又名:延胡、玄胡索、元胡索等。罂粟科、紫堇属多年生草本植物,块茎球形,花瓣紫红色;蒴果圆柱形,两端渐狭。夏季开花。性味辛,苦,温。入肝、胃经。有活血,散瘀,理气,止痛功效。植物内生真菌是指那些在其生活史的一部分或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部的而不使被感染的宿主植物表现出外在明显病症的真菌,可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物的方法来证明其内生。植物内生真菌属于特殊生境微生物的范畴,绝大多数具有耐盐、耐碱、耐酸、耐冷等特性,并且可产生与宿主相同或相似代谢产物,也是新颖化合物的重要来源。本研究选用陕西城固野生延胡索为实验材料,对野生延胡索内生真菌分离、纯化,并进行形态学、分子生物学鉴定,筛选出代谢产功能酶、解磷真菌菌株及解磷内生真菌中有抑菌活性菌株,探究4株解磷内生真菌在PKO液体培养基中溶解无机难溶磷能力的变化。1.延胡索内生真菌的分离鉴定选取陕西城固野生延胡索新鲜块茎为实验材料,应用综合马铃薯培养基对内生真菌进行分离纯化,共分离内生真菌312株,纯化菌株用PDA斜面低温保藏。通过形态学和分子生物学方法对65株不同形态型菌株进行鉴定,结果表明分别属于镰刀菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、毛霉属(Mucor)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、赤壳属(Nectria)、木耳属(Auricularia)、根霉属(Rhizopus)、散囊菌属(Eurotiomycetes)。2.延胡索产功能酶菌株的筛选采用纤溶酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、接触酶、复合酶、壳聚糖酶筛选培养基从65株不同形态型菌株中筛选出产功能酶菌株,25株产纤溶酶,24株产复合酶,23株产碱性蛋白酶,12株产接触酶,1株产纤维素酶;其中5株内生真菌具有4种不同产酶活性,为代谢产多酶系菌株。野生延胡索内生真菌产功能酶菌株的筛选结果显示了延胡索内生真菌的代谢多样性,并且具有作为纤溶酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、接触酶、复合酶工程菌株的潜在价值。3..延胡索解磷内生真菌研究通过无机磷固体培养基和蒙金娜有机磷固体培养基进行溶磷菌株的筛选,结果表明65株试验菌中有25株是解无机磷内生真菌,2株解有机磷内生真菌,其中编号为YH-84(简青霉)的菌株具有双解活性。野生延胡索解磷内生真菌的筛选结果同样显示了延胡索内生真菌的代谢多样性,并且补充了特殊生境解磷微生物的研究。通过改良的菌块法筛选25株解磷内生真菌中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌有拮抗作用的菌株,YH-102对4种供试指示菌具有强抑菌活性,YH-84对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有强抑菌活性,其它菌株并未显示出强抑菌活性。在pH8,28℃暗培养条件下,分别以200μL、1000μL为接种量,PKO液体培养基分别用蔗糖、麦芽糖、甘露醇、酪素、酵母浸粉、KNO3代替原碳、氮源,探究解磷内生真菌溶解Ca3(PO42能力的变化。当接种量为200μL酵母浸粉做氮源、葡萄糖做碳源时,YH-129发酵液中最高可溶磷含量是5.178 mg/L;当接种量为1000μL时,4株内生真菌发酵液可溶磷含量均有明显增加。在36 h时,YH-119、YH-129发酵液中可溶磷含量最高;在40 h时,YH-84、YH-215发酵液中最大可溶磷含量达到5.754 mg/L。野生延胡索解磷内生真菌在接种后的40 h内,碱性条件下具有一定溶解Ca-P的能力。
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