尽管CRISPR/Cas9系统是一个强大的、不可思议的基因组编辑工具,但人们在实际应用中还是发现其并不是没有缺陷。对于PAM-free和CRISPR受限制的区域,当下通常使用的CRISPR/Cas9系统都不能有效的编辑,而其较高的脱靶几率则使其不能得到更广泛的应用。为了改进这些缺陷,我们开发了一个非常简单的基于CRISPR/cas9的无质粒一步法(CAGO)基因组编辑技术,它不需要构建一个来表达特定的gRNA的质粒。而是通过构建一个具有极高靶向效率的通用N20序列,以同源重组的方式插入到大肠杆菌的染色体中,然后诱导CRISPR/Cas9在通用N20序列处切割双链DNA造成染色体双链断裂,再诱导染色体重组修复以完成编辑过程。实验已证明这一技术能够没有任何副作用的编辑CRISPR受限制的DNA区域。当应用到多位点编辑时,CAGO可以在两天内以几乎100%的编辑效率编辑一个靶目标。此外,稍微调整后的CAGO能够用于编辑多达100kbp的大片段区域,编辑效率达到75%。最后,在CAGO的基因组编辑方法构建中,通过应用模块化的设计策略,进一步简化了供体DNA线性片段的转换过程和构建。虽然该技术是在大肠杆菌中建立的,但只需要经过微小的调整它就可以应用于其他的微生物。对特定位点的基因组编辑是生物学研究中最重要的技术之一,尽管已经建立了各种基因组编辑技术,但常规技术通常只处理一个基因组靶位点。开发微生物细胞工厂时通常需要对多个基因组目标进行编辑。因此,开发能够在最短的时间内同时编辑多个位点的技术是当下研究的热点。然而,转化效率、重组效率和复杂编辑质粒的构建阻碍了多位点编辑技术的发展。在本研究中,我们开发了一种基于CRISPR/Cas9的多基因组编辑技术(CMGE)。采用这种编辑技术,将所有功能部件组装成可复制的质粒,并采用严格的诱导表达系统来控制Cas9蛋白的表达,将质粒转化过程与编辑过程分离,以保证获得最大的编辑效率。复杂的多grna质粒通过设计一种模块化的组装策略进行构建。此外,长期存在的多份基于质粒的供体DNA拷贝增加了编辑系统的效率。通过实验验证,这种技术对两个和三个靶位点的编辑效率分别达到了100%和90%,而四个靶位点也可以被有效编辑,平均效率为40%。这是大肠杆菌多基因编辑技术的报道中效率最高的。CMGE虽然是在模型生物中发展起来的,但也可以通过一些调整来应用到其他原核宿主。这是一种可以广泛应用的方便技术,无需特殊要求,任何生物实验室都可以轻易使用。