论文部分内容阅读
蜂王浆（Royal jelly,RJ）,为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂（Apis cerana cerana Fabricius）及意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）之工蜂咽腺分泌的乳白色胶状物,其成分十分复杂,是一种天然的营养物质。目前有关于RJ对整体动物抗肿瘤、抗衰老的研究,但关于其对哺乳动物正常或肿瘤细胞影响的研究,还少有报道。目前仅见有蜂王浆主蛋白对人胚胎肺成纤维细胞的抗衰老作用研究[1]。本研究试图探讨蜂王浆对人肿瘤细胞（Hela、HepG2细胞）增殖的影响,以及对小鼠正常细胞（NIH-3T3）氧化应激衰老的对抗作用及其机理。1.RJ对Hela、HepG2细胞的增殖和凋亡作用本实验通过CCK-8检测不同浓度的顺铂对HepG2和Hela细胞的抑制作用,选择50μg/mL的顺铂作为阳性对照。之后检测不同浓度蜂王浆（1、5、10、25、50、80、100μg/mL）对HepG2和Hela细胞的抑制作用,结果显示,10μg/mL的RJ对Hela细胞有约55%的抑制率;25μg/mL的RJHepG2有约45%的抑制率,更高或更低浓度,抑制率均更低。这个抑制率明显低于顺铂的约80%的抑制率。2.蜂王浆（RJ）对小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）细胞的抗氧化应激作用本实验首先采用CCK-8法检测不同浓度H2O2对NIH-3T3增殖活力的影响。选择20μg/mL浓度的H2O2建立细胞氧化应激衰老模型。检测不同浓度的RJ对模型细胞增殖的影响,并观察细胞形态的改变。结果发现5、10、20μg/mL的RJ在不同时间段对细胞增殖均有显著促进作用,故选择这三个RJ有效浓度进行后续实验,进一步探究RJ对模型细胞传代时间间隔、细胞寿命以及细胞衰老程度（β-半乳糖苷酶阳性细胞率）的影响。结果表明添加了RJ（5、10、20μg/mL）的模型细胞传代时间间隔有所下降,其中以10μg/mLRJ组的传代时间间隔下降最多。说明一定浓度的RJ能够有效逆转H2O2导致的细胞生长速度减慢这一情况;同时10、20μg/mLRJ组的细胞寿命（PDLs）有所延长,其中10μg/mL组的细胞寿命明显升高（p<0.01）;SA-β-Gal染色结果表明RJ能够改善H2O2引起的细胞氧化应激衰老,且浓度为10μg/mL时,这种作用最明显。3.蜂王浆（RJ）对NIH-3T3细胞的抗氧化应激作用的机制本实验通过H2O2建立氧化应激衰老模型,再加入不同浓度的RJ作用于模型细胞,通过Hoechst33342/PI双染色法,检测RJ对模型细胞凋亡的影响;测定谷胱甘肽过氧化物酶含量;用流式细胞仪检测细胞生命周期;用实时荧光定量聚合酶链式反应法（qRT-PCR）细胞中p16、p21及p53基因的mRNA表达水平的变化。结果显示RJ可以抑制H2O2引起的细胞凋亡,对其引起的细胞坏死影响不大;RJ可以增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力,加强分解过氧化物的能力,在一定程度上保护细胞免受氧化应激的损伤;与正常组相比,H2O2诱导的模型细胞S期显著减少,阻滞在G1期,RJ（5、10、20μg/mL）组细胞S期增加,10μg/mL时增加最多,说明RJ可以改善H2O2在细胞中诱导的G1阻滞,使更多的细胞进入S期,从而促进细胞分裂;RJ能够降低模型细胞中p16、p21、p53基因mRNA的表达量,说明RJ改善细胞的G1阻滞作用和它能够在翻译以前的环节抑制p16、p21和p53基因的表达,通过p16-cyclinD/CDK-RB、p53/P21信号通路对细胞周期进行调控有关。