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疫苗免疫是动物疫病防控最主要策略之一。在动物疫病疫苗研制中,抗原运送载体在抗原发掘以及提升疫苗安全性和有效性中具有重要作用。随着艾美耳属球虫反向遗传操作平台及其激发宿主免疫应答检测系统的建立与不断完善,转基因艾美耳属球虫作为疫苗载体具备了可行性。本研究从抗原因素(主要是抗原的空间位置、表达量、持续时间/方式)和宿主因素(免疫受体-配体和细胞因子)进行优化,进而提升表达异源抗原的转基因球虫激发的免疫保护力,从而为推进艾美耳属球虫作为疫苗载体提供数据支撑。为了研究病原抗原的表达量对转基因球虫激发宿主免疫应答的影响,本研究以增强型黄色荧光蛋白(EYFP)和禽流感病毒M2e抗原为模型,通过调控异源抗原表达的不同元件、P2A介导的单表达框共表达多抗原以及异源抗原多拷贝串联表达等多种策略增强转基因球虫表达异源抗原的量。结果显示,SAG13强启动子显著增强EYFP的表达水平;艾美耳属球虫可高效利用P2A的自我剪切功能实现多异源蛋白的共表达;多拷贝串联的M2e的表达水平显著高于单拷贝表达。进一步地,提升转基因球虫表达异源抗原(EYFP或M2e)的量,其激发宿主产生特异性免疫应答的水平显著提升。结果表明,转基因球虫表达异源抗原的量是其激发高水平免疫应答的关键因素之一。为了研究宿主因素对转基因球虫激发宿主免疫应答的影响,本研究将细胞因子或免疫受体的配体表达于转基因球虫,通过细胞因子或免疫受体的配体作为分子佐剂增强球虫免疫原性反映宿主因素对球虫抗原递呈的影响。结果显示,表达鸡白细胞介素2的转基因球虫(EmiChIL-2)激发宿主更强的细胞免疫应答,体液免疫无显著提升。同样,表达巨型艾美耳球虫Profilin的转基因柔嫩艾美耳球虫(Et-EmPro)的免疫原性显著增强,并且Et-EmPro免疫后芽孢杆菌在鸡群肠道菌群的比例显著提升。表达分子佐剂的转基因球虫(EmiChIL-2和Et-EmPro)免疫鸡群后都表现出更强的抵抗野生型球虫感染的保护力。结果提示,细胞因子和免疫受体的配体等宿主因素可显著影响宿主的免疫应答,是介导球虫抗原有效递呈的关键因子。为了研究表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主产生的保护性免疫应答,本研究将弓形虫的膜抗原1(TgSAG1)和巨型艾美耳球虫的免疫优势抗原IMP1(Immune mapped protein 1,EmIMP1)和AMA1(Apical membrane antigen 1,EmAMA1)分别表达于柔嫩艾美耳球虫。结果显示,表达TgSAG1的转基因球虫不仅能够激发鸡群产生TgSAG1特异性的免疫应答,保护免疫鸡群抵抗部分弓形虫的感染。而且,表达TgSAG1的转基因球虫子孢子免疫小鼠后,激发小鼠产生Th-1型免疫应答,提供抵抗弓形虫感染的部分免疫保护力,延长小鼠存活时间。表达EmIMP1的转基因柔嫩艾美耳球虫免疫后,可保护鸡群抵抗巨型艾美耳球虫的感染,并且免疫保护力随着表达免疫优势抗原虫种的增加,即表达EmMP1和表达EmAMA1的转基因柔嫩艾美耳球虫共同免疫后,保护力得到加强。结果说明,球虫作为疫苗载体可有效运送和递呈异源病原的免疫优势抗原至宿主免疫系统,启动保护性免疫应答。综上,优化病原因素可显著提升转基因球虫表达异源抗原特异性的免疫应答,优化宿主因素可显著提升球虫抗原特异性的免疫应答,为研发安全有效的新型球虫病疫苗虫株和球虫载体亲本虫株奠定基础。球虫作为疫苗载体表达的异源病原优势抗原可被宿主免疫系统识别,产生良好免疫保护力。从实践证实转基因球虫作为疫苗载体具有可行性。