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1.研究背景及目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是以自身免疫功能紊乱为特征的特发性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’ s disease,CD),发病率高、病势缠绵、治疗难度大,新治疗方法的研发十分必要。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是在上世纪70年代由中国科学家从菊科蒿属植物中提取得到的青蒿素的衍生物,是临床广泛应用的抗疟药物。除了治疗疟疾外,双氢青蒿素也被发现对红斑狼疮、类风湿关节炎以及多发性硬化等自身免疫病具有缓解病情和调节Th/Treg平衡的作用,但其对炎症性肠病的作用及机制研究尚在起步阶段。在化学方法诱导的小鼠炎症性肠病模型中,恶唑酮(Oxazolone,OXA)和 2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠模型在组织病理学特征方面与人类UC和CD类似,并且分别适用于对Th9和Th1/Th17的研究。本文基于Th/Treg平衡调节,探索DHA对小鼠IBD模型的药效作用和免疫调节机制,为进一步拓展青蒿素类药物临床新适应症奠定基础。2.研究方法和内容2.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究建立恶唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠炎症性肠病模型,以DHA4mg/kg/d、8mg/kg/d、16mg/kg/d为低、中、高剂量,地塞米松磷酸钠注射液1mg/kg/d为阳性药,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,正常对照(Negative Control,NC)和OXA模型组、TNBS模型组予等剂量溶剂,共给药3次,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,评价疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出OXA模型小鼠结肠组织和TNBS模型小鼠小肠组织,清洗后擦干平铺,观察大体病变程度,称重并记录长度,以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠结肠组织中Th9细胞转录因子PU.1和细胞因子IL9、Th22细胞转录因子AHR和细胞因子IL22、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例,利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠小肠组织Th1细胞转录因子T-bet和细胞因子IFN γ、Th17细胞转录因子RORγt、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子ROR y t以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,在抗CD3/CD28抗体激活条件下,予DMS0或DHAO.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml培养72h后计算细胞存活率;予DMSO、DHAO.8mg/ml、SnPP(HO-1抑制剂)30nmol/ml或DHA+SnPP培养72h后计算细胞存活率,并采用ELISA法检测细胞培养上清中Heme Oxygenase-1(HO-1)的表达水平,PI双染法检测细胞凋亡比例。在OXA模型中,分离提取小鼠结肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小鼠结肠组织中凋亡细胞比例;在TNBS模型中,分离提取小鼠小肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小肠组织中凋亡细胞比例。2.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响建立OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型,将小鼠分为NC组、模型组、DHA16mg/kg/d组、SnPP30umol/kg/d组、DHA+SnPP组,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,SnPP分别在造模后Oh,24h和48h颈后皮下注射,NC和模型组予等剂量溶剂,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,DAI评分。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出结肠或小肠组织,清洗后擦干并以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子RORγt以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.6统计方法采用Graphpad Prism 7软件分析数据,统计数据均以x±S表示,多样本之间采用单因素方差分析,不同时间点数据采用重复测量方差分析,取P<0.05具有统计学意义。3.研究结果3.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究1.模型验证:造模后模型组小鼠饮食饮水减少,蜷缩懒动,腹泻、便血、肛周污秽,体重下降,病变部位可见明显充血水肿甚至糜烂溃疡,组织切片染色后可见病变组织结构异常,伴大量淋巴细胞浸润及大面积组织纤维化,提示小鼠炎症性肠病模型造模成功。2.对于OXA模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,结肠缩短,重量变轻,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.对于TNBS模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,小肠重量变轻,小肠组织H&E染色结果显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色结果显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,小肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠组织PU.1、IL9和IL22的mRNA水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3的mRNA水平明显降低;与模型组小鼠相比,DHA降低了PU.1、AHR、IL9和IL22的mRNA的表达水平,升高Foxp3和IL10的mRNA表达水平。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th9和Th22细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th9和Th22细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠固有层淋巴细胞PU.1蛋白表达水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA剂量明显降低了PU.1和AHR的蛋白表达水平,升高了 Foxp3的表达。2.对于TNBS模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠组织ROR γ t的mRNA水平明显升高,T-bet和IFN －均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3均值降低,但不具有统计学差异;与模型组小鼠相比,DHA降低了T-bet、RORγt和IFN y的mRNA的表达水平,升高了 Foxp3的表达水平,升高了 IL10平均值,但不具有统计学差异。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th1和Th17细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th1和Th17细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγγt蛋白表达水平明显升高,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA降低了 T-bet和RORγ t蛋白表达水平,升高了 Foxp3水平。3.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响1.细胞存活率结果显示,DHA(0.1-1.6 mg/ml)对激活CD4+T淋巴细胞具有明显抑制作用,HO-1抑制剂SnPP(30 nM)能够明显降低DHA(0.8mg/ml)的抑制作用。ELISA结果显示,DHA升高了细胞上清中HO-1的蛋白表达,SnPP能够明显抑制HO-1表达,SnPP能够明显减弱DHA对HO-1的升高作用。PI双染法结果显示,DHA能够明显促进激活CD4+T细胞的凋亡,SnPP能够明显减弱DHA的促凋亡作用。2.对于OXA模型,DHA能够明显降低模型小鼠结肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠结肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用;3.对于TNBS模型,DHA能够明显降低模型小鼠小肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠小肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用。3.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响1.对于OXA模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,结肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了结肠组织纤维化面积。2.对于TNBS模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,小肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了小肠组织纤维化面积。3.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th9比例更高,Treg比例更低,SnPP+DHA对Th22比例升高了平均值,但不具有统计学差异;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对结肠固有层淋巴细胞PU.1和AHR蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。2.对于TNBS模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th1、Th17比例更高,Treg比例更低;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对小肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγt蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。4.结论1.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病有缓解作用;2.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群有调节作用;3.DHA基于介导HO-1的表达促进激活CD4+T细胞的凋亡;4.DHA基于介导HO-1的表达缓解OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病;5.DHA基于介导HO-1的表达调节OXA和TNBS小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群平衡。