条斑紫菜(Porphyra yezoensis)R-藻红蛋白的制备及其抗氧化、抗肿瘤活性研究

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我国藻类资源十分丰富,是世界上最大的紫菜生产大国,集中在江苏沿海的养殖和加工,其产量占全国的95%以上。紫菜中丰富的藻红蛋白,因其抗氧化、抗癌、增强免疫力等功效,在食品、化妆品、医疗等领域得到日益广泛的应用。本文以江苏产量丰富的条斑紫菜为原料,制备了R-藻红蛋白,对其结构特性进行了研究,并通过体外活性试验评价了其生物活性,具体结果如下:条斑紫菜经超声细胞破碎、硫酸铵二次盐析、超滤膜超滤、结晶一周后,提取得到的R-藻红蛋白纯度为2.05,达到药品级要求(A562nm/A280nm>2)。用DEAE Cellulose-52 (2.6×40 cm)层析纯化R-藻红蛋白,NaCL浓度为0.2 mol/L时,洗脱出R-藻红蛋白主峰,洗脱液呈粉红色,纯度最高达5.24,符合试剂级要求(A562nm/A280nm>4)。通过紫外-可见光谱鉴定DEAE Cellulose-52柱层析得到的试剂级R-藻红蛋白的纯度,吸收波长为562 nm,540 nm处有一肩峰。SDS-PAGE电泳分离得到R-藻红蛋白的α和β亚基,α亚基的相对分子质量约为16 kDa,p亚基的相对分子质量约为19 kDa。荧光光谱分析得到,条斑紫菜纯R-藻红蛋白的激发波长为477 nm,最适发射波长为在572 nm。傅立叶转换红外光谱(FTIR)测定结果显示,药品级R-藻红蛋白,在1656 cm-1和1454 cm-1之间的双峰表明R-藻红蛋白结构中存在共轭双键。R-藻红蛋白中,含有除色氨酸外的7种必需氨基酸,占氨基酸总量的37%,含量从高到低的顺序是:亮氨酸>缬氨酸>苏氨酸>异亮氨酸>赖氨酸>苯丙氨酸>蛋氨酸。在所有的氨基酸中,呈鲜味浓的谷氨酸的含量最多,其次是丙氨酸和天门冬氨酸。R-藻红蛋白的还原力测定、羟自由基和超氧阴离子清除率的测定,证实R-藻红蛋白具有较强的还原力和抗氧化作用,对羟自由基清除率的IC50值为608.9μg/mL,在超氧阴离子清除实验中,对邻苯三酚自氧化速率的抑制率高达80.7%.R-藻红蛋白对人胃癌细胞SGC和乳腺癌细胞MCF进行的48h抑制作用研究结果表明,在实验剂量范围内,随R-藻红蛋白浓度的增加而抑瘤作用增大.对SGC的抑制,R-藻红蛋白浓度为800μg/mL时,抑制率为23.58%。当R-藻红蛋白的浓度为200μg/mL时,对MCF的抑制即达30.03%;R-藻红蛋白浓度增至1600μg/mL,其抑制率超过50%.R-藻红蛋白对两种癌细胞的抑制都呈剂量正向关系。Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的药品级R-藻红蛋白作用SGC 48h凋亡诱导的作用情况,对照细胞的总凋亡比例为5.04%,100、200、400、800、1600μg/mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为9.21%、5.80%、7.02%、9.71%和9.31%;R-藻红蛋白对MCF细胞的凋亡诱导实验中对照组的总凋亡比例为0.56%,而100、200、400、800μg/mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为38.68%、19.17%、20.99%和24.76%。
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