背景：我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区,目前HBsAg携带率达7.18%,超过1.1亿人,需要进行抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者约为2000万,其中25%-40%可发展为肝硬化和肝癌;每年约70万人死于乙肝相关并发症,包括肝硬化(liver cirrhosis, LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC),乙肝病毒感染严重威胁着人民的生命健康。目前尚无根治HBV感染的药物,我国慢性乙型肝炎抗病毒治疗专家共识及慢性乙型肝炎防治指南中对慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的总体治疗目标是：最大限度地长期抑制或消除HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化,延缓疾病进展,减少和防止肝脏失代偿、LC、HCC及其并发症的发生,从而改善生活质量和延长存活时间。推荐的乙肝药物包括干扰素和核苷(酸)类似物,目前上市的推荐药物对慢性乙型肝炎治疗的长期疗效有限,例如已上市核苷类似物虽然口服给药,使用方便,但疗程不确定,仅局限于抑制HBV DNA的复制,对肝细胞核内的复制模板cccDNA无清除作用,而且在抑制HBV复制后,如果没有发生HBeAg和(或)HBsAg的血清学转换,停药后出现较高的复发率,同时,耐药的发生以及何时停药等,也是困扰临床医师和患者的重要问题；干扰素虽然较少出现复发和耐药,但有效率仅有30%左右,且注射途径应用不便,不良反应较多,并有应用人群的局限性。因此,临床上迫切需要探索新的治疗方法,以解决目前抗病毒治疗过程中存在的问题。近年来的研究表明,慢性乙型肝炎之所以久治不愈,与患者体内的免疫水平相对低下,多种免疫细胞的数量减少且有功能缺陷,导致患者自身的免疫系统不能有效清除乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)有关。HBV侵犯肝脏细胞,在肝细胞内复制繁殖而不能被清除,造成肝脏炎症的同时引起肝脏的慢性纤维化,最终发展成为肝硬化和肝癌。要最大限度的清除病毒、缓解和减轻肝脏的炎症、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌的进展,除了应用抗病毒治疗外,增加自身免疫细胞数量、增强患者免疫系统的功能、进行免疫重建是一条治疗CHB的新思路,因此,免疫细胞治疗是非常值得尝试的技术手段。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK细胞)治疗技术是免疫细胞治疗技术的一种,其作用机理可能是通过白体免疫细胞对病毒感染细胞的细胞毒性和分泌多种细胞因子(如：IFN-γ)发挥抑制或清除患者体内的HBV的作用。目前国家卫生部发布了首批应用的第三类医疗技术目录,自体免疫细胞治疗技术被明确列入了第三类医疗技术目录。目前已有应用CIK细胞治疗CHB的临床报道。树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)。体内、体外研究均表明DC是机体免疫反应的始动者,可有效的激活细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的免疫反应。目前研究显示：CHB患者体内DC功能不全可能是导致CHB慢性化的原因之一。本实验通过比较不同培养条件对CIK细胞及DC的影响,并初步探讨DC对CIK的作用,为今后的临床应用提供质量可靠的CIK及DC细胞。目的：探讨体外不同培养条件对CIK细胞及DC的影响,通过比较,摸索最佳的CIK细胞及DC的体外培养条件,以符合临床应用的需求。并初步探讨DC对CIK细胞的作用。方法：在细胞因子条件相同的情况下,应用不同培养基(AIM V, OpTmizer)培养CIK细胞；在培养基相同的情况下,应用不同亚型的抗CD3单克隆抗体(antiCD3 monoclonal antibody, antiCD3-mAb) UCHT1、OKT3诱导CIK细胞。应用粒细胞集落刺激因子(Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)及白介素4(interleukin 4, IL-4)常规诱导DC细胞,不同的培养基(RPMI1640、AIM V、PAA(Quantum 007 for lymphocytes, PAA))培养DC细胞；应用不同的促成熟方案(cocktail、tumor necrosis factorα(TNF-α))促DC细胞成熟；自体及不同浓度的异体血浆培养DC细胞。将负载HBcAg并促成熟的DC细胞与CIK细胞共孵育。结果：1.应用AIM V、及OpTmizer体外培养CIK细胞,CIK细胞大小不一,形状各异：圆形,长条形、不规则形；部分细胞形成集落生长。在培养的第14天,OpTmizer与AIM V比较细胞扩增倍数为27.52：9.45(P<0.05)；细胞表型比较,0天时,CD56+细胞比例为(27.17±9.32)%,第14天时,AIM V组升至(65.20±21.67)%,而OpTmizer组升至(66.97±21.42)%,两组与基线比较p<0.05；0天时,CD3+CD56+细胞比例为(6.00+5.66)%。第14天时,AIM V组升至(33.34+21.89)%,OpTmizer组升至(26.81+21.90)%,两组比较无显著性差异,但与基线比较,AIM V组p<0.01, OpTmizer组p<0.05。选取3例行对K562的细胞毒性试验,当效靶比分别为40：1、20：1、10：1、5：1时,AIM V与OpTmizer比较无显著性差异。2.应用同种异型的anti-CD3mAb (UCHT1、OKT3)培养CIK细胞,显微镜下观察,两种培养条件下,CIK细胞较PBMC变大,台盼兰拒染实验检测细胞活力均>90%,两组无明显差异。在培养的第14天,OKT3:UCHT1增殖倍数分别达到470.94：33.73(P<0.05)。分别于培养的0天、14天应用流式细胞仪对两组细胞进行分析比较：0天时,CD3+CD8+细胞比例为(28.82+13.36)%,OKT3组升至(74.94±11.45)%,UCHT1组升至(47.27±29.38)%,两组比较P<0.05。0天时,CD56+细胞比例为(27.17±9.32)%,第14天时,OKT3组降至(16.24±13.96)%,而UCHT1组升至(38.91±25.23)%,两组比较P<0.05。选取3例行对K562的细胞毒性试验,当效靶比分别为20：1,OKT3、UCHT1比较为(5.01±8.69)%：(44.65±20.14)%,P=0.078。3.体外应用PAA、RPMI1640及AIM V培养基体外培养DC,三种培养基诱导的不成熟DC (immature dendritic cells, iDC)形态：1640培养基培养的DC为半贴壁状态,细胞圆而透亮,表面具细小突起,大部分为单个,少数聚集成簇。而PAA培养基培养的DC细胞伸长贴壁；AIMV培养基培养的DC形状各异,大部分贴壁,细胞呈梭形,胞质向外延伸。促成熟后,流式细胞仪检测显示：三种培养基培养的DC纯度均达到80%以上。在诱导成熟后,三种培养基对DC表达HLA-DR、CD80、CD83、CD86分子的平均荧光强度平均值分别为：RPMI1640:294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67、AIM V: 289.55±72.65、169.65±42.25、180.65±45.60、302.86±52.74、PAA:298.31±116.60、132.18±15.02、175.57±91.48、142.36±17.57、4.采用不同促成熟方案(cocktail、TNF-α)刺激DC细胞,流式细胞仪检测HLA-DR、CD80、CD83、CD86的平均荧光强度平均值：cocktail:294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67。TNF-α:290.18±57.38、130.07±25.49、91.33±4.86、83.97±28.77。5.分别采用含2%自体血浆、10%自体血浆、2%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、10%FBS的RPMI1640完全培养基体外培养DC细胞,流式细胞仪检测HLA-DR、CD80、CD83、CD86的平均荧光强度平均值,2%自体血浆分别为407.60±130.12、139.67±84.13、177.71±37.59、199.60±86.91；10%自体血浆分别为377.10±60.00、134.18±81.25、127.25±20.61、179.66±64.85；2%FBS：262.15±84.16、207.28±41.56、196.21±91.58、132.75±42.80；10% FBS：294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67。6.DC与CIK共培养：DC体外培养第6天,加入HBcAg,孵育24小时,之后加入cocktail促成熟,24小时后与自体CIK细胞共孵育,mDC与CIK细胞比例为1：10。mDC-CIK与CIK细胞增殖比较,共孵育三天后,mDC-CIK细胞增殖倍数为3.99±1.75倍,而未加入DC的CIK细胞增殖倍数为3.25±1.75倍,两组比较有显著性差异(P=0.007)。mDC-CIK混合培养的第14天及CIK培养的第22天,流式细胞仪检测扩增的细胞亚群的变化：CD3+、CD56+、CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+细胞百分比均无显著性差异。五聚体检测针对HBcAg18～27V细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell CTL), PBMC、mDC-CIK、CIK分别为：0.16%、1.98%、2.21%、HBcAg18～27I特异性CTL, PBMC、mDC-CIK、CIK分别为：0.17%、1.67%、1.95%。结论：1.在仅加入1%自体血浆的情况下,AIM V及OpTmizer均能较好的扩增CIK细胞,而不加自体血浆扩增效率明显下降甚至扩增失败。在体外培养的第14天,两种培养基扩增CD3+CD56+细胞频数相似,但OpTmizer培养的CIK细胞的绝对数量明显高于AIM V,这说明了OpTmizer较AIM V更能诱导出大量的CD3+CD56+细胞。而且评估两种培养条件下CIK细胞对K562的杀伤效果是相似的,这进一步提示了OpTmizer更适合体外诱导培养CIK细胞。2.研究发现应用不同亚型的抗CD3单克隆抗体诱导的CIK细胞,流式细胞仪检测细胞大小,可见细胞体积较PBMC明显增大,表明两种抗CD3单克隆抗体均可使细胞活化增殖。OKT3扩增CIK细胞总数明显高于UCHT1,其主要成为CD3+CD8+细胞,而相对CD56+细胞的比例较低。通过细胞毒试验,我们发现UCHT1的杀伤效果较OKT3组增强,这提示了CIK细胞中高比例的CD56+细胞可能较CD3+CD8+对于杀伤肿瘤细胞更加重要。3. AIM V、PAA及RPMI1640培养基培养的DC细胞,促成熟后,细胞表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达均明显升高,AIM V及RPMI1640培养基培养的DC细胞,促成熟后,细胞表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达均明显升高,但AIM V培养的DC在未成熟状态低表达CD80、CD83,而成熟时则高表达上述分子,表明：AIM V培养的DC可以保持较好的未成熟及成熟状态,因此采用AIM V培养基更加适合体外培养DC。4.在本实验中,流式细胞仪检测显示：DC诱导活化后,CD83、CD80、CD86和MHCⅡ分子HLA-DR都有上调。尽管数据显示TNF-α在一定程度上能够活化DC,但Cocktail法活化DC的表面分子表达更高一些。特别是DC的特异性成熟标记CD83的表达,Cocktail组显著高于TNF-α组,而且HLA-DR、CD80、CD83、CD86的MFI值,cocktail亦均高于TNF-α组,而且表面分子的共表达,Cocktail组显著高于TNF-α组,表明Cocktail活化方案更能够有效地诱导DC成熟。5.本实验提示：2%自体血浆、10%自体血浆、2%FBS、10%FBS培养DC的方案均能用于培养DC细胞,并且诱导生成的DC能被Cocktail诱导活化,虽然应用自体血浆可以使CD86分子表达高于FBS, CD80分子表达低于FBS,但没有统计学差异。在今后的临床应用过程中可以考虑应用少量自体血浆培养DC细胞,避免宿主对异种血清感染或过敏的风险。6.DC与CIK共培养,初步研究结果表明：mDC可以刺激CIK细胞增殖,但对增殖的细胞亚群没有明显影响。五聚体检测的两例无症状HBsAg携带者HBcAg18～27V及HBcAg18～27I特异性CTL,与PBMC相比,CIK及mDC-CIK均明显升高,mDC-CIK与CIK没有差别,本研究提示CIK细胞在扩增过程中可能会使针对HBV的特异性CTL出现增殖。