近年来随着转基因技术的快速发展,转基因作物种类和种植面积的逐年增加,转基因随之带来的安全问题也日益引人注目,对转基因的监管已成为转基因技术发展过程中的重要任务。传统的转基因检测方法主要针对单一或少量转基因物质的检测,但随着转基因种类的增多,传统的检测方法不仅消耗时间和人力,而且不能满足从未知样品中检测出所有可能存在的转基因物质。鉴于此,研发高通量的检测技术已成为转基因检测领域的一个重要研究方向。当前的转基因高通量检测技术主要基于核酸物质,而基于蛋白质的高通量检测技术尚未得到很好的发展。本文以微流体核酸芯片为基片,通过核酸杂交固定抗体探针,构建了一种新型的微流体蛋白质芯片,并应用于转基因成分的检测,以期为转基因检测提供一种快速、灵敏的高通量分析平台。本论文的主要结果如下：1.抗体-寡核苷酸的交联及交联物性质分析本文通过对抗体和寡核苷酸进行基团修饰,而后经双苯腙键生成对两者进行交联的化学方法合成抗体-寡核苷酸交联物。在此基础上,采用UV/vis,SDS-PAGE等方法对交联的反应、纯化、封闭等步骤进行跟踪分析,并对最终的交联物进行鉴定,以此确定成功合成抗体-寡核苷酸交联体的优化方案。研究结果表明,经紫外光谱分析和比尔-朗伯定律计算测量得到平均每个抗体上结合了3-4条寡核苷酸;通过ELISA方法对交联过程中抗体活性的变化进行分析,结果表明基团修饰后的抗体活性没有受到大的影响,而寡核苷酸结合后的抗体与抗原结合的效率有所下降,原因可能由核酸的空间干扰引起。2.抗体在μParafloTM寡核苷酸芯片上的固定合成针对6种不同转基因蛋白的抗体-寡核苷酸交联体,通过将交联体与微流体芯片表面的寡核苷酸探针杂交的方式将抗体固定到芯片表面,通过Cy3标记二抗与已固定抗体结合来显示抗体在芯片表面上固定的位置。通过对杂交条件的优化,得到高特异性的杂交条件,即含25%甲酰胺杂交稀释缓冲液,30℃下与芯片表面杂交2h,然后用含0.2%SDS的杂交洗涤液洗去多余交联体。采用不同浓度的交联体与芯片表面的寡核苷酸探针进行杂交,用同等浓度转基因蛋白溶液进行检测并对检测信号强度进行比较,最终确定以50nM作为最优的交联体杂交浓度。3.转基因蛋白的芯片检测通过对不同条件下,检测转基因蛋白获得的信号强度进行比较,确定以4℃过夜孵育作为抗原结合条件。在此基础上,用优化的交联体杂交方法合成蛋白质芯片,对6种不同转基因蛋白进行梯度浓度试验,结果表明大部分抗原的检测限位于0.1-0.5ng/mL。将该结果与ELISA检测结果比较,发现芯片的灵敏度与ELISA相当；对于部分ELISA检测结果较差的样品,芯片的检测效果显著提高。上述结果表明本研究合成的蛋白质芯片能够适用于转基因蛋白的检测。4.探针的再生和基片的重复使用根据核酸双链解离原理将抗体探针从芯片表面去除,使蛋白质芯片重新回复到核酸芯片状态。采用同样的抗体固定方法在原有的核酸芯片表面再次合成蛋白质芯片,在再生芯片上进行同等条件下的抗原检测试验,比较再生后的芯片与初始芯片的检测结果,得到三次再生芯片上的检测结果间变异系数为10.52%。但再生芯片的灵敏度基本不受影响,结果证实了芯片重复使用的可行性。5.蛋白芯片合成的灵活性在微流体芯片上合成“GMO”字样的多组寡核苷酸探针阵列,继而将核酸芯片转化为蛋白质芯片。将6种转基因蛋白的混合溶液在芯片表面进行检测,结果获得多组信号,各组阵列之间的检测信号一致,此结果展示了基于本研究平台灵活构建高通量蛋白质芯片的可行性。