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目的构建含有心肌特异性启动子心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT启动子)和胸腺肽β4(Thymosinβ4, Tβ4)基因并引入Myc标签的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体质粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc, CMV启动子介导的pAAV-CMV-Tβ4-Myc重组质粒,并包装6型和9型重组腺相关病毒,体外感染原代心肌细胞(Primary cardiomyocytes),观察rAAV6病毒介导T(34-Myc基因在原代心肌细胞中的表达。方法1. pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc重组质粒构建以pAAV-cTnT-Tβ4为模板,PCR特异性扩增并插入BamHI、NotI双酶切位点和引入Myc标签的Tβ4-Myc片段,再分别BamHI、NotI双酶切Tβ4-Myc片段和现有质粒pAAV-cTnT-Tβ4、pAAV-CMV-GFP,连接构建成重组质粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc和pAAV-CMV-Tβ4-Myc。2.r AAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-Tβ4-Myc等重组病毒的包装、检测用pAAV-cTnT-Tβ34-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc等载体质粒,含rep基因、cap基因的包装质粒pAAV6或pAAV9,辅助质粒pHelper,通过三质粒共转染法转染293细胞,即可得到重组6型和9型腺相关病毒载体,纯化后的病毒采用Dot Blot法检测病毒滴度,SDS-PAGE检测病毒纯度。3.rAAV6-CMV-Tp4-Myc病毒表达功能的验证用rAAV6-CMV-Tp4-Myc丙毒感染原代心肌细胞,48h后进行DAB染色、DAPI染色及两者混合染色。4.rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒表达的检测用rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒感染原代心肌细胞,提取蛋白后行Western Blot检测Tβ4-Myc基因的表达。结果1.成功构建了pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc载体质粒2.成功包装了rAAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-GFP、rAAV9-CMV-GFP、rAAV6-CMV-GFP-Myc五种病毒。3.rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒能在原代心肌细胞内表达。4.rAAV6-CMV-Tβp4-Myc病毒感染原代心肌细胞后能介导Tβ4-Myc基因表达。结论成功构建了重组腺相关病毒的载体质粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、 pAAV-CMV-Tp4-Myc。并包装rAAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV。 Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-GFP、rAAV9-CMV-GFP、rAAV6-CMV-GFP-Myc五种病毒。rAAV6病毒在体外感染原代心肌细胞能介导Tβ4-Myc基因表达,为进一步rAAV9病毒载体体内基因治疗心肌缺血打下了坚实的基础。