柑橘因根毛稀少主要依赖与丛枝菌根真菌共生来吸收水分和矿质营养,因此研究柑橘丛枝菌根共生形成的分子机理具有重要的理论和实践意义。本研究以柑橘常用砧木枳（Poncirus trifoliata（L.）Raf）为材料,采用i TRAQ和LC-MS/MS技术分析了植物菌根共生形成早期过程中蛋白质磷酸化水平变化,挖掘可能参与菌根共生的候选蛋白。为了能够快速有效的研究柑橘菌根共生的分子机理,本研究建立了发根农杆菌介导的柑橘毛根转化并探索CRISPR/Cas9技术在柑橘中的应用。此外,丛枝菌根真菌作为一种真菌,和其他病原真菌一样,有多种表面分子包括几丁质、葡聚糖。而这些分子同样能够激发宿主植物的免疫反应。但是在菌根共生过程中,植物并没有出现免疫反应抵制共生的形成,而是顺利与丛枝菌根真菌形成共生。本研究新发现了一类菌根植物特有的LysMe基因并鉴定了其在植物响应菌根共生中的功能。主要研究结果如下:1.柑橘菌根磷酸化蛋白质组分析挖掘早期响应菌根共生关键基因以柑橘常用砧木枳（Poncirus trifoliata（L.）Raf）为研究材料,以接种和不接种丛枝菌根真菌Rhizophagus intraradices的根为样本,分别提取总蛋白,进行高通量的磷酸化蛋白质组学分析。磷酸化蛋白质组学分析在实验组和对照组中共鉴定到1016个磷酸化蛋白和2308个磷酸化位点,其中有118个差异显著磷酸化蛋白以及29个磷酸化位点基序例如[SDDE]、[PXSP]。差异显著的磷酸化蛋白中,有12个激酶和磷酸酶与植物免疫相关,并且有8个在根瘤共生和菌根共生中具有相似的磷酸化水平变化。本研究探索了植物菌根共生形成早期的磷酸化变化过程,有助于阐明共生早期的信号交流的机制。2.建立发根农杆菌介导的柑橘毛根转化体系并探索柑橘了CRISPR/Cas9技术本研究利用发根农杆菌,以砧木枳为植物材料,建立了快速得到柑橘毛状根的方法。需要的转化时间短,转化效率高（阳性根转化效率为29.8%）,能够通过红色荧光快速筛选阳性根,为柑橘菌根共生研究提供一种便捷的技术。此外,我们还尝试建立柑橘CRISSRP/Cas9系统,对前人研究的载体进行改造,使用枳U6 sn RNA启动子进行驱动sg RNA的表达。通过烟草瞬时表达体系和分离黄色蛋白（YF-FP）报告系统检测CRISPR/Cas9的编辑活性。在实验组中,我们检测到黄色荧光蛋白,说明YF-FP基因被Cas9所编辑。随后,我们选用柑橘PDS基因作为靶基因去验证这套CRISPR/Cas9系统是否能够在柑橘中进行编辑。转化的三个载体都得到白化苗,而对照没有。但是PCR检测及测序发现目标PDS靶位点区域并未发生编辑。具体白化原因以及枳中是否还存在其它被编辑的PDS基因还需要后续实验验证。3.植物菌根特异性诱导LysMe基因的功能研究植物LysMe蛋白家族的系统进化树分析发现植物LysMe蛋白主要分为两大分支,其中一个分支只有菌根宿主植物,而不含有非宿主植物例如拟南芥,这一分支的LysMe基因是菌根植物特有的保守基因。在苜蓿中有3个菌根诱导型Lysme基因分别命名为Mt LysMe1、Mt LysMe2、Mt LysMe3。它们的启动子-GUS分析发现,该类基因主要在菌根丛枝所在的细胞表达,不接种菌根真菌时不表达;烟草叶片瞬时表达分析发现,3个苜蓿LysMe蛋白都是定位在质外体,被细胞分泌到胞外。对其中的Mt LysMe3进行基于自身启动子的亚细胞定位分析,结果表明Mt LysMe3-m Cherry融合蛋白主要定位在植物与菌根真菌互作形成的丛枝结构周围。这些结果意味着菌根特异性诱导的LysMe蛋白在丛枝细胞表达后被分泌到丛枝周围发挥作用。对LysMe进行RNA干涉分析,结果显示Mt Ly Me2或Mt Ly Me3的干涉会导致植株根系侵染率下降,表现为菌丝和丛枝减少且发育受阻。说明LysMe基因的表达量下降会影响菌根共生的形成。为探究其作用机理,我们在大肠杆菌中进行原核表达并分离纯化LysMe蛋白,进行体外多糖结合实验。结果表明LysMe对几丁质和纤维素有微弱的结合作用,推测其可能通过结合几丁质等物质来避免激活植物免疫反应。综上所述,本研究调查了柑橘响应菌根的磷酸化蛋白;建立了柑橘毛根转化体系并探索了柑橘CRISPR/Cas9技术的可行性,为后期柑橘菌根功能研究提供了一种新方法。此外,本研究鉴定到一类在菌根植物特有的,在共生过程中特异性受菌根诱导表达并且在丛枝部位高表达的LysMe基因。丛枝细胞表达的LysMe蛋白被分泌到胞外环丛枝空间。Mt LysMe基因的表达被干涉后抑制菌根共生的形成,菌丝和丛枝量显著减少且丛枝发育受阻。