论文部分内容阅读
莱茵衣藻因叶绿体表达系统相较于大肠杆菌、酵母等表达系统具有很多优势，一直被认为是理想的生物反应器，然而衣藻叶绿体中多基因操纵子表达量较低一直是束缚衣藻商业化生产重组蛋白的限制条件。 在这项研究中我们致力于寻找一种基因间表达调控元件(IEE，intercistronicexpression element)，其为一段短的序列，通常在基因间隔区，转录后可形成RNA茎环二级结构，增强mRNA稳定性，将多顺反子高效地处理成稳定的单顺反子，从而赋予下游顺反子的可翻译性。它同时提供了一个新的通用工具，用于叶绿体中多个外源基因堆叠，实现多种蛋白同时表达，提高质体转基因表达的成功率，有助于扩大叶绿体转化技术的应用。 本论文的主要内容及结果如下: (1)提取莱茵衣藻总DNA，从总DNA中克隆出衣藻内源性启动子PpsbA，终止子，同源序列，构建了莱茵衣藻“aadA表达盒”，作为后续实验的对照质粒。 (2)以莱茵衣藻总DNA为模板，扩增出了两个潜在的基因间表达处理元件(IEE，intercistronic expression element)，与本试验前期克隆的表达壮观霉素抗性基因aadA和表达卡那霉素抗性基因nptⅡ一起成功地构建了两个衣藻叶绿体双顺反子测试表达载体。 (3)通过玻璃珠法、电击法及基因枪法将载体转入到莱茵衣藻叶绿体中，优化电击转化的电场强度，及筛选转化子的最佳抗生素浓度，发现最佳电场强度为1000V，最低壮观霉素浓度为100μg/mL，卡那霉素浓度为50μg/mL。 (4)通过壮观霉素筛选及反复继代培养，获得转基因藻株，并经过卡那霉素抗生素筛选，初步表明IEE已发挥作用，但在PCR分子水平检测上还存在些问题，质粒在叶绿体中的存在方式等确切结论还有待进一步研究。