卵巢恶性肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一,其中卵巢癌占其85％～90％,虽然手术、化学药物治疗、放射治疗等传统治疗手段不断改进,卵巢癌的治疗效果改善甚微,其5年生存率徘徊于30％～40％,病亡率居妇科恶性肿瘤之首。　　 临床上卵巢癌好发于绝经和卵巢切除术后妇女[1],常伴有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的升高;而多次妊娠、母乳喂养、口服避孕药和接受激素替代疗法的妇女发病风险较低[2],FSH和LH也较低。近20年来有关研究也表明FSH对卵巢癌的发生发展起重要作用,但其对卵巢癌细胞生物学行为的影响研究甚少。本课题研究表明FSH与卵巢癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管内皮生长因子(VEGF)有关联;通过对FSH调控卵巢癌VEGF的相关分子机制、卵巢癌临床资料和动物实验的研究分析,将有助于卵巢癌的病因研究,为新的治疗药物和方法的产生提供依据。　　 本课题共分四部分:①卵泡刺激素对卵巢癌细胞增值、凋亡、迁移、侵袭和血管内皮生长因子的影响;②卵泡刺激素调控卵巢癌细胞血管内皮生长因子的相关分子机制;③卵巢癌相关临床资料的分析;④动物实验。　　 第一部分卵泡刺激素对卵巢癌细胞增值、凋亡、迁移、侵袭和血管内皮生长因子的影响　　 目的：研究FSH对卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管内皮生长因子的影响。　　 方法：将FSH以不同浓度(0、10、20、40、80、160mIU/mL)分别作用于1×105或2.5×106个SKOV-3细胞和6×104或1.5×106个ES-2细胞,其中FSH作用于SKOV-3细胞的适宜时间为48h,ES-2细胞为24h,二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色法分别测定细胞的增殖活性;流式细胞仪分别检测细胞凋亡和细胞周期情况;明胶酶谱法测定细胞培养上清液中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性;双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量;免疫印迹法测定SKOV-3和ES-2细胞内MMP-2和VEGF蛋白表达的变化;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法测定细胞MMP-2和VEGFmRNA含量;划痕和侵袭实验检测细胞的迁移侵袭能力。　　 结果：(1)随着FSH浓度的增加,SKOV-3和ES-2细胞的增殖活性均较对照有明显增强,差异均有统计学意义(P＜0.01)。(2)FSH可抑制SKOV-3和ES-2细胞凋亡。(3)FSH作用后,可促进SKOV-3和ES-2细胞周期的改变。(4)FSH可提高SKOV-3和ES-2细胞MMP-2和VEGFmRNA和细胞浆中MMP-2和VEGF蛋白含量及细胞培养上清液中MMP-2活性和VEGF蛋白的表达。(5)FSH可促进SKOV-3和ES-2细胞的迁移侵袭能力。　　 结论：FSH可促进卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞的凋亡,促进VEGF的表达。　　 第二部分FSH调控卵巢癌细胞血管内皮生长因子的相关分子机制　　 目的：研究FSH调控卵巢癌细胞血管内皮生长因子的相关分子机制。　　 方法：将FSH以不同浓度(0、10、20、40、80、160mIU/mL)分别作用于2.5×106个SKOV-3细胞或1.5×106个ES-2细胞,分别检测pAKT/AKT、pERK/ERK、survivin、缺氧诱导因子-1α(HIP-1α)的表达,分别针对AKT、survivin、HIF-1α的mRNA各设计了3条特异性的siRNAs和一条阴性对照non-targetsiRNA,并分别克隆入pRNA质粒载体。将重组质粒转染SKOV-3和或ES-2细胞,用RNA干扰(RNAi)分别抑制细胞中AKT、survivin或HIF-1α的表达,采用Westernblot检测干扰的效果;同时应用特异性的PI3K/AKT通路阻断剂LY294002抑制AKT的磷酸化和特异性的MAPK通路阻断剂U0126抑制ERK1/2的磷酸化,在无FSH刺激或FSH刺激的条件下,研究相关因素之间的关系。　　 结果：(1)随着FSH浓度的增加,SKOV-3细胞的survivin和HIF-1α的表达明显增强。(2)在无FSH刺激的条件下,survivin或HIF-1α的RNAi均可使SKOV-3细胞的VEGFmRNA及胞浆蛋白表达下降。在FSH刺激的条件下,仅仅survivin的RNAi仍可使SKOV-3细胞的VEGFmRNA及胞浆蛋白表达下降,HIF-1α的RNAi无明显抑制作用。FSH可能主要是通过survivin促进VEGF表达的。(3)随着FSH浓度的增加,SKOV-3和ES-2细胞的pAKT的表达明显增强,pERK的表达无明显变化。(4)AKT的RNAi或PI3K/AKT通路阻断剂LY294002均可抑制FSH引起的SKOV-3和ES-2细胞中AKT磷酸化的下调,进而引起survivin的表达下降;MAPK通路阻断剂U0126可抑制ERK1/2的磷酸化,但不能有效抑制FSH引起的SKOV-3和ES-2细胞中survivin的上调。　　 结论：FSH可能是通过P13K/AKT通路促进卵巢癌细胞survivin的表达,进而促进VEGF的表达。　　 第三部分AKT和pAKT在卵巢癌组织中的表达　　 目的：探讨pAKT/AKT在不同卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系。　　 方法：以用免疫组织化学的方法分别检测pAKT/AKT在82例不同卵巢癌组织(其中21例卵巢浆液性囊腺瘤、18例卵巢交界性浆液性囊腺瘤、26卵巢浆液性囊腺癌和17卵巢透明细胞癌)中的表达,并用卡方检验和生存分析等了解它们与卵巢癌预后的关系。　　 结果：与卵巢浆液性囊腺瘤相比,卵巢浆液性囊腺癌pAKT和AKT的阳性表达率更高(P＜0.01),pAKT和AKT的表达与肿瘤分化程度、2年和5年生存率有关联,生存分析也表明pAKT和AKT表达阳性的卵巢浆液性囊腺癌患者5年生存率分别为15％(3of20)和14.3％(3of21),pAKT和AKT表达阴性的卵巢浆液性囊腺癌患者5年生存率分别为66.7％(4of6)和80％(4of5),均远高于前者。　　 结论：pAKT/AKT的表达可能与卵巢癌的预后有关联,抑制pAKT/AKT的表达可能有助于改善卵巢癌患者的预后。　　 第四部分卵泡刺激素对卵巢癌细胞在裸鼠体内生长的影响　　 目的：采用体内实验,探讨在皮下注射FSH的条件下,裸鼠皮下移植卵巢癌组织的生长与其的关系。　　 方法：SKOV-3细胞培养方法同第一部分。经连续传代后,将细胞浓度调整为2.5×107个/ml,取0.2ml注射于18裸鼠皮下,随机分成3组,每组6只。进行下列处理:将裸鼠随机分成3组,每组6只。进行下列处理:(1)生理盐水组:皮下注射0.1ml生理盐水,每天1次。(2)FSH1低剂量加药组:皮下注射FSH(3IU·只·d-1),每天1次。(3)FSH2高剂量加药组:皮下注射FSH(10IU·只·d-1),每天1次。SKOV-3细胞连续注射29天。ES-2细胞为22天。每三或四天观察荷瘤裸鼠并绘制移植瘤的生长曲线,并称取裸鼠体重。注射完药物后,采用摘除左眼球方法,收集裸鼠血液,采集血浆测FSH浓度,取出皮下移植瘤称重。　　 结果：在体内实验中我们发现注射FSH药物的裸鼠血药浓度可达绝经后水平。各组裸鼠体重无明显变化。低剂量加药组裸鼠移植瘤的体积和重量均高于生理盐水组并有统计学差异,高剂量加药组裸鼠移植瘤的重量高于生理盐水组并有统计学差异,但高剂量加药组裸鼠移植瘤的体积与生理盐水组比较无统计学差异。　　 结论：FSH与卵巢癌的发生、发展有关联。　　 综上所述,FSH可促进卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞的凋亡,促进VEGF的表达。FSH可能是通过PI3K/AKT通路促进卵巢癌细胞survivin的表达,进而促进VEGF的表达。pAKT/AKT的表达可能与卵巢癌的发生有关联。体外实验也提示FSH可能与卵巢癌的发生、发展有关联。本课题为进一步研究卵巢癌的发病机制提供了新的思路,为卵巢癌的基因治疗提供了新的靶点。