细胞膜离子通道是调节细胞兴奋性的一类重要膜蛋白结构,也是仅次于G蛋白耦联受体的药物作用重要靶点,钾离子通道亚型多,功能复杂,潜在的病理、生理和药理学意义重大。KCNQ基因编码的Kv7钾通道是电压依赖性钾离子通道家族中重要的一类,目前发现KCNQ通道共有KCNQ1⁵五种亚型,其中KCNQ2、KCNQ3是构成神经细胞M型钾离子通道的分子基础。M通道的开放剂可降低神经元兴奋性,因此可用于治疗与过度神经元兴奋相关的疾病,如惊厥、癫痫和神经性疼痛等,现在M通道已经成为了新药开发研究的重要靶点之一。钙激活氯通道（Ca CCs）介导了包括跨上皮离子与液体分泌、心肌和神经兴奋、感觉传导、平滑肌收缩和受精过程等众多生理过程。TMEM16A基因被报道为Ca CCs的可能分子基础后,其成为了众多研究者的研究焦点,并取得了一些进展。TMEM16A或许会成为治疗多种人类疾病,如囊性纤维性病、高血压、胃肠蠕动障碍、哮喘和肿瘤的新型药物靶点。寻找新颖的KCNQ/M通道和Ca CCs离子通道特异性调节剂,建立优化高效的离子通道药物筛选平台,无论是对离子通道的深入基础研究还是对以通道为靶点的创新药物开发都具有重要意义。本课题针对性地设计合成了大量的以开放KCNQ/M通道和阻断Ca CCs通道为目标的新结构化合物,并建立、完善了基于ICR8000的KCNQ和Ca CCs通道调节剂的筛选方法。通过对合成化合物进行高通量筛选,最终发现了多个高活性的M通道和Ca CCs离子通道调节剂,并对M通道的最优选开放剂进行了合成工艺研究。第一部分吡唑并[1,5-a]嘧啶酮类KCNQ2/3钾离子通道开放剂的设计合成筛选及构效关系研究目的:设计、合成一系列吡唑并[1,5-a]嘧啶酮类化合物（PPOs）,对其进行KCNQ2/3（M）通道开放活性高通量筛选,并进行构效关系研究。方法:以不同的取代乙腈为原料,经三条反应路线,缩合和环合两步反应,得到重要中间体取代5-氨基吡唑,中间体再与不同的取代β-酮酸酯在平行合成仪中进行微量平行合成,得到大量PPOs化合物;以化合物26,58为原料,对其4位亚胺基甲基化,7位羰基氯代;将稳定转染了KCNQ2/Q3通道的CHO细胞以2×105个/孔的密度接种于96孔板。设置100μM,30μM,10μM,3μM,1μM,0.3μM和0.1μM七个浓度梯度,每个浓度设三复孔,已知M通道开放剂Retigabine（RTG）为阳性对照,用铷离子流出高通量筛选方法测定化合物的M通道开放活性。结果:共设计、合成PPOs母核化合物120个,化合物26,58结构修饰化合物6个,其中新化合物大于110个。全部化合物都进行了KCNQ通道高通量活性筛选,并完成了初步的构效关系研究。阳性对照药Retigabine激活KCNQ2/Q3的EC50值在0.30⁰.50μM之间,先导化合物26和化合物28激活KCNQ2/Q3通道的EC50值分别为2.27±1.02μM和1.46±0.36μM。结构改造得到的优选化合物58（QO-58）和化合物60的EC50值分别为0.06±0.01μM和0.15±0.02μM,与Retigabine具有相似的效能。化合物QO-58激活KCNQ1通道的EC50值为49.29±7.04mM。结论:合成的化合物绝大部分为新化合物,筛选得到的活性化合物都通过HPLC-MS和NMR进行了结构鉴定和HPLC-DAD纯度检查。对先导化合物进行结构优化后得到优选化合物QO-58,该化合物经由高通量筛选方法得到的激活KCNQ2/Q3通道的EC50的值达到了0.06±0.01μM,效价优于Retigabine,效能与Retigabine相似。化合物QO-58是一种新颖、高效、选择性较好的KCNQ通道开放剂。该系列化合物已经获得中国专利和国际PCT保护并申请了美国专利,对于治疗癫痫和神经性疼痛,具有进一步研究开发的重大价值。第二部分QO-58L合成工艺研究目的:对QO-58进行成盐（L-赖氨酸）合成（QO-58L）;按照新药临床前研究标准对优选化合物QO-58和QO-58L的合成工艺进行优化,并为药理毒理学实验提供药品。方法:第一步成钠盐:单因素比较金属钠新鲜制备乙醇钠和工业乙醇钠的区别,通过L9（34）正交实验确定最佳反应参数。第二步取代5-氨基吡唑环合:HPLC实时监测,单因素考察三氟乙酸、分子筛的影响,确定反应时间和反应温度。第三步QO-58环合:考察反应时间和溶剂加入量的影响,优化后处理过程。第四部成盐反应:选择成盐的溶剂及用量。对优化后的合成工艺进行10倍放大验证。结果:（1）金属钠溶于绝对乙醇中,金属钠完全溶解后,加入苯乙腈,60℃搅拌5 min后,保温,以约1 ml/min的速度滴加三氟乙酸乙酯（钠:苯乙腈:三氟乙酸乙酯=1:1:1.2）,滴毕,微沸回流反应2 h,冷却至室温,回收溶剂,溶于水中,用二氯甲烷洗涤,水层减压蒸干。（2）中间体2和硫酸肼（1:2）,3埃分子筛置于碳酸二甲酯（DMC）中,微沸回流反应3.5 h。减压抽滤,减压回收溶剂套用,得到的产物可不经处理直接用于下一步反应。（3）中间体3（上一步全部产品）和氟氯烟酸酯（1:1）溶于冰乙酸中,回流反应4 h,反应结束后,减压回收部分溶剂,冷却过滤,固体依次用冰醋酸,水洗至中性,加入无水乙醇回流10 min,充分冷却后过滤,水洗,干燥。（4）取QO-58和L-赖氨酸（1:1）加热溶于20倍（以QO-58质量计）95%乙醇中,减压滤过,回收溶剂得到QO-58L。总产率约为35%。结论:优化后的合成工艺原料来源广,价格低,溶剂（DMC）绿色环保并可以重复套用,操作简单,对设备要求低,完全符合新药研究开发工艺优化的评价标准。放大验证实验证明了工艺的稳定及可靠性,得到的QO-58和QO-58L纯度基本可以满足原料药的要求。第三部分钙激活氯通道调节剂的设计合成筛选及高通量筛选方法的建立目的:设计合成三个系列钙激活氯通道（Ca CCs）阻断剂,建立Ca CCs调节剂高通量筛选方法,并对合成的化合物进行筛选。方法:（1）羧酸衍生物的合成:以邻氨基苯甲酸类NSAIDs为主的芳酸与不同的胺或醇在盐酸EDC和DMAP存在条件下进行缩合反应。塞来昔布类似物的合成:取代苯乙酮在甲醇钠条件下与三氟乙酸乙酯进行缩合反应,然后再与取代肼进行环合。羧酸类化合物的合成:卤代芳酸或者氯代芳酸酯在不同条件下与取代苯胺发生亲核取代反应;氨基芳酸与取代苯甲醛反应得席夫碱,然后氰基硼氢化钠还原。（2）Ca CCs高通量筛选平台的建立:ICR8000测定Ag离子（通过Ag-Cl反应间接测得Cl离子浓度）浓度的方法学研究,包括线性,准确度和精密度研究;考察细胞密度、反应时间及所用缓冲液的组成等不同因素对氯电流（氯离子流出）的影响,从而确定最佳反应条件。筛选所用Ca CCs通道为稳定表达于CHO细胞的TMEM16A。阳性对照药设置5个浓度梯度对筛选方法进行验证。（3）所测试化合物设置300μM,100μM,30μM三个浓度梯度,用建立的筛选平台对合成的化合物进行初步筛选,对筛选得到的活性化合物设置更多的浓度梯度进行量效曲线的测定。结果:（1）合成羧酸衍生物（酰胺,酯类）化合物38个,塞来昔布衍生物10个,羧酸类化合物10个。（2）Ca CCs通道筛选平台的建立:ICR8000系统测定银离子浓度,标准曲线相关系数r2=0.9979,日间与日内精密度分别小于等于5.68%和6.15%,准确度均在20%以内,准确灵敏,方法学研究符合要求。（2）筛选流程:1孵育:快速吸去培养基,加入200μl Incubation buffer(含Eact 25μM,KCl 150 m M,Ca²⁺4 m M和待测药物),放置37℃中孵育15 min。2洗涤:吸去Incubation buffer,用Wash buffer快速洗涤三次,每次200μl。3打开通道:洗涤完成后,加入200μl Open buffer(含Ionomycin 10μM,葡萄糖酸钾100 m M,Ca²⁺4 m M),37℃反应12 min。4反应测定:吸取190μl反应后的Open buffer到另一块96孔板,每孔中加入Ag NO3溶液30 ul（50 ppm）,混合均匀后,室温避光静置24 h,取100μl进ICR8000测定上清液中的银离子,并计算氯电流。（3）用新建方法筛选,阳性对照药Ca CCinh-A01（C38）、氟芬那酸（Flu）和NPPB均表现出对表达在CHO细胞中的TMEM16A（Ca CCs）通道氯电流的浓度依赖性抑制作用。NPPB在300μM浓度,C38在100μM时对氯电流的抑制率均可达100%,二者的半数抑制浓度（IC50）值分别为39.35±4.72μM和6.35±0.27μM。合成的羧酸类化合物抑制活性为C56>C58>C49≈C50>C54>C57,塞来昔布羧酸衍生物C39、C40、C41、C42及羧酸衍生物C15、C31、C34均表现出了较强的Ca CCs通道抑制作用。结论:合成化合物均经过HPLC-DAD纯度检查,可以满足筛选需要。建立的Ca CCs高通量筛选方法高通量、低消耗、高效率、高灵敏度,数据准确真实可靠。合成的每个系列化合物中均发现了具有Ca CCs通道抑制活性的化合物,以其为先导化合物,进行继续深入研究具有重要意义。