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半枝莲,别名牙刷草、窄叶韩信草、并头草等,唇形科黄芩属植物的干燥全草,味辛、苦、寒,归肺、肝、肾经,全草可入药,在我国分布广泛,资源丰富,是中医传统处方和成药中的常用中药,具有清热解毒,散瘀止血,利尿消肿、抗癌等功效。现代药理学研究也表明其具有清热解毒、活血化瘀、利尿消肿、抗毒蛇咬伤等作用,常用于治疗毒蛇咬伤、各种感染、水肿、肿瘤等疾病,单方或复方应用于治疗胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤。半枝莲全草含有多种活性化学成分,其中黄酮类化合物含量最高,是主要的活性成分,分离鉴定出野黄芩苷、芹菜素、黄芩苷、木犀草素等近50种黄酮类化合物,具有心血管保护、抗致病微生物、抗肿瘤、抗自由基、保护肝脏等多种药理活性。对半枝莲黄酮类化合物抗肿瘤活性的研究显示,其通过抑制肿瘤细胞增殖、增敏化疗药物疗效、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等发挥抗肿瘤活性,其多种黄酮单体显示具有明显抑制肿瘤细胞增殖活性,具有广泛的研究和开发应用前景。临床试验结果显示,多靶点抑制剂在治疗肿瘤方面优于单靶点抑制剂,多靶点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发的发展方向。半枝莲黄酮活性成分是否也能通过调节肿瘤免疫而发挥多靶点治疗肿瘤作用,尤其在调节肿瘤免疫过程中能否发挥中药双向调节的优势,目前国内外相关研究很少涉及,本研究在课题组前期工作基础上,以半枝莲黄酮活性成分、半枝莲黄酮单体芹菜素和木犀草素为研究对象,通过MTT实验、细胞凋亡分析、细胞内信号通路表达等实验,研究半枝莲黄酮活性成分双向调节肿瘤免疫作用及可能的机制,主要结果如下：1.半枝莲黄酮活性成分影响细胞增殖及细胞表面分子CD86/CD40表达乙醇提取半枝莲黄酮类化合物,以石油醚、乙酸乙脂、正丁醇分别萃取得各部分化合物,以200～750nm吸收光谱扫描各部分化合物。通过MTT实验观察半枝莲黄酮活性成分对小鼠脾细胞和小鼠肉瘤S180细胞增殖的作用,结果显示：半枝莲黄酮可促进小鼠脾细胞体外增殖、抑制S180细胞增殖作用。应用MTT实验观察半枝莲黄酮主要单体芹菜素、木犀草素对小鼠脾细胞和S180细胞增殖的作用,结果显示：芹菜素体外抑制小鼠脾细胞和S180细胞增殖,木犀草素体外促进脾细胞增殖、而抑制S180细胞增殖。提示半枝莲黄酮活性成分体外促进小鼠脾细胞增殖可能与其主要活性黄酮单体木犀草素活性有关,体外抑制S180细胞增殖可能与其主要活性单体芹菜素和木犀草素抗肿瘤活性有关。提示半枝莲黄酮活性成分的双向调节作用可能与其主要黄酮单体对不同细胞增殖的双向调节作用有关。应用PI单染法观察芹菜素、木犀草素对细胞凋亡的影响,活性氧试剂盒检测细胞内活性氧水平。结果显示：芹菜素显著升高脾细胞和S180细胞内活性氧水平,芹菜素促进脾细胞和S180细胞凋亡,提示芹菜素可能通过显著升高脾细胞活性氧,进而诱导细胞凋亡抑制细胞增殖。木犀草素升高了脾细胞内活性氧水平,脾细胞凋亡减少,可能通过轻度升高细胞内活性氧水平,进而促进脾细胞增殖。木犀草素降低S180细胞内活性氧水平,促进S180细胞凋亡,提示木犀草素促进细胞凋亡可能不是通过细胞内活性氧途径。应用ICR小鼠S180移植瘤体内法观察小鼠脾细胞表面分子CD86、CD40表达水平的情况。结果显示：11d后,移植瘤模型对照组小鼠体重变化不明显,而木犀草素组小鼠体重明显增加；木犀草素组小鼠脾指数明显下降,芹菜素组小鼠胸腺指数明显下降；木犀草素组小鼠脾细胞表面分子CD40、CD86阳性细胞数明显增加,提示芹菜素、木犀草素具有调节肿瘤免疫活性。2.芹菜素诱导ANA-1细胞凋亡并调控其MAPK信号通路应用MTT实验检测芹菜素对小鼠巨噬细胞ANA-1细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡细胞比例、细胞内活性氧水平,TUNEL实验和DNA ladder检测细胞DNA断裂情况,Western blot检测凋亡相关蛋白和MAPK表达情况。实验结果显示：芹菜素浓度和时间依赖地抑制ANA-1细胞增殖、促进细胞凋亡,芹菜素显著提高细胞内活性氧水平,下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Caspase-8水平,同时在不影响ERK、JNK、P38表达的情况下,影响磷酸化ERK、JNK、P38表达。这些结果提示,芹菜素可能是通过增加细胞内ROS,调节MAPK信号通路,进而抑制Bcl-2通路,诱导小鼠巨噬细胞ANA-1发生凋亡,芹菜素可作为干扰细胞免疫的调节剂进一步进行研究和开发。3.木犀草素对ANA-1细胞增殖的低剂量兴奋效应及潜在机制应用MTT实验检测木犀草素对小鼠巨噬细胞ANA-1细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡细胞比例、细胞内活性氧水平,TUNEL实验细胞DNA断裂情况,Western blot检测Bcl-2和Akt/ERK/JNK蛋白表达情况。实验结果显示：木犀草素对ANA-1细胞增殖具有低剂量兴奋效应,即低剂量木犀草素促进ANA-1细胞增殖、高剂量抑制细胞增殖的双向调节作用。木犀草素浓度依赖地提高细胞内活性氧水平,低浓度(～200μmol/L)木犀草素浓度和时间依赖地促进ANA-1细胞增殖,影响细胞周期,高浓度(>200μmol/L)木犀草素抑制ANA-1细胞增殖、促进细胞凋亡,下调Bcl-2表达,同时在不影响Akt、ERK.JNK表达的情况下,影响磷酸化Akt、ERK、JNK表达。结果提示低浓度木犀草素可能是通过增加细胞内ROS,调节Akt/ERK/JNK信号通路,影响细胞周期,促进细胞增殖,高浓度木犀草素可能是通过增加细胞内ROS,调节Akt/ERK/JNK信号通路,进而抑制Bcl-2通路,诱导细胞发生凋亡。以上结果提示中药半枝莲黄酮活性成分具有双向调节抗肿瘤免疫作用,也能通过调节肿瘤免疫而发挥多靶点治疗肿瘤作用,其机制可能与其黄酮单体芹菜素和木犀草素调节脾细胞和肿瘤细胞内活性氧、调节巨噬细胞内活性氧及相关信号通路蛋白表达有关。本研究为解释半枝莲黄酮抗肿瘤的作用机制提供一定的科学依据,为进一步研究其抗肿瘤作用机制奠定一定的科学基础。