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我国是桃的发源地,具有丰富的种质资源,按照果肉颜色,桃分为红肉桃、白肉桃和黄肉桃等。红肉桃果肉呈血红色,有血桃之称,品质优良,外观诱人,为我国桃属植物中的特色资源。红肉桃花青苷生物合成受基因表达调控,并且具有时空表达差异特性。因此,关于红肉桃果实着色相关的关键基因克隆以及生物信息学研究对从分子水平揭示红肉桃花青苷生物合成的机理有重要意义。
本研究首先建立高质量高丰度的红肉桃果实cDNA文库,为基因的分离克隆奠定基础;确定红肉桃果实花青苷合成相关的关键酶,克隆出7个红肉桃果实花青苷生物合成的关键功能基因;采用RACE技术获得1条花青苷生物合成相关调节基因MYB转录因子,具体研究结果如下:
1.红肉桃果实cDNA文库的构建
以改良的SDS法从红肉桃品种‘胶州血桃’和‘大把撸’果肉中提取总RNA,分离纯化富含PolyA的mRNA,经反转录酶反转录合成双链cDNA,通过CHROMASPIN-400柱筛选出其中大于500bp的片段与载体pDNR-LIB连接,最后用电转化法转化宿主菌ElectroMAXDH5α,构建了两个红肉桃果肉的cDNA文库。经质量检测,‘大把撸’cDNA文库库容量约为1.20×107cfu/ml,‘胶州血桃’cDNA文库库容为5.00×107cfu/ml,平均插入片段长度为1.0kb~2.0kb之间,符合高质量文库的要求。说明文库完整有效,可用于大规模EST序列测定及数据分析。
2.红肉桃果实花青苷生物合成的关键结构基因的鉴定
利用RT-PCR法克隆花青苷生物合成代谢相关基因,根据桃、李、梨和苹果等果树上的花青苷生物合成代谢相关同源基因的高度保守性,设计合成简并引物。获得了7个红肉桃果实花青苷生物合成的关键功能基因片段,包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase),查尔酮合成酶(chalconesynthase),查尔酮异构酶(Chalconeflavononeisomerase),黄烷酮羟化酶(flavanone3-hydroxylase),二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol-4-reductaseprotein),花色素合成酶(Anthocyanidinsynthase),及无色花青素双加氧酶(leucoanthocyanidindioxygenase)。并且也已获得桃18srRNA基因片段,这为下一步利用实时定量PCR技术来分析花青苷合成代谢相关功能基因在红肉桃果实不同发育时期中基因表达差异打下了基础。
3.调节基因MYB转录因子的分离
使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit,获得1条花青苷生物合成相关调节基因MYB转录因子(PpMYB10,GenBank登录号为GU936492),经Blastn同源性检索结果表明该基因与其他已报道的果树MYB转录因子同源性分别为:欧洲李(Prunusdomesticasubsp,EU153579)97.4%,酸樱桃(Prunuscerasus,EU153582)88%,与榅桲和欧楂的相似性在80.0%左右,与苹果比较相似性在79.0%左右。说明所分离基因与MYB转录因子氨基酸序列有非常高的同源性。这为进一步作基因的功能研究打下基础。