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目的:
1.将抗erbB2的单链抗体可变区基因scFv通过基因工程的方法与人IgG1 Fc段基因、CD28跨膜区基因和CD3(ζ)链基因相连接,从而形成anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)融合基因,然后与IgK-chain信号肽序列连接,并将该融合基因连接到逆转录病毒表达载体pLNCX上,构建表达质粒pLNCX/Igκ-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)。
2.将重组表达质粒转染T细胞株JUrkat,使融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)表达于细胞膜上,从而获得一种靶向治疗erbB2过表达肿瘤的基因重组T细胞。
即针对erbB2过表达肿瘤,构建含anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)融合基因的T细胞,为erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。
方法:
1.融合基因及重组表达载体的构建
用高保真DNA聚合酶,应用PCR方法分别从质粒pSecTag2B、重组质粒pPIC9K/scA21及重组质粒pBullet上扩增目的片段.Igκ信号肽序列、anti-erbB2scFv和Fc-CD28-CD3(ζ)。再经过两次SOE-PCR构建融合基因IgK-anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)(scFv与Fc之间无linker)；利用TA克隆方法将融合基因克隆到pMDl9-T simple载体上,经HindⅢ酶切鉴定克隆载体及测序进一步鉴定融合基因序列的正确性。
分别对构建好的pMDl9-T Simple重组克隆质粒和逆转录病毒表达载体pLNCX,用限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ进行双酶切,用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化融合基因片段和pLNCX载体片段,利用T4连接酶连接。将连接产物转化到E.coli DH-5α感受态细胞中,并应用带氨苄青霉素抗性的LB固体培养基筛选,挑取单个阳性菌落,菌落PCR初步鉴定后,LB液体培养基培养,提取纯化质粒,进行酶切及测序鉴定。
2.稳定转染人T淋巴瘤细胞株Jurkat并检测融合基因表达情况
把重组表达载体pLNCX/IgK-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)采用脂质体lipofectin2000和电穿孔方法分别转染Jurkat细胞株,先用流式细胞术检测融合基因瞬时表达情况,然后用G418筛选,获得稳定转染Jurkat细胞株,提取稳定转染Jurkat细胞株基因组DNA行Igr-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)特异性PCR鉴定,最后再采用流式细胞术检测融合基因稳定表达情况。
结果:
1.重组表达载体pLNCX/IgK-anti-erbB2 seFv-Fe-CD28-CD3(ζ)的构建
通过普通PCR分别扩增得到三段目的基因片段IgK-chain、anti-erbB2 scFv和Fc-CD28-CD3(ζ),经过两次SOE-PCR成功构建融合基因Igk-anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),并克隆至T载体,得到重组克隆质粒pMD19-T Simple/Igk-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),经测序鉴定序列正确。重组克隆质粒pMD19-T Simple/Igk-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)逆转录病毒表达载体pLNCX经双酶切、连接,成功构建重组表达质粒pLNCX/Igk-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),经PCR及测序鉴定,证实重组表达质粒pLNCX/Igk-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)序列正确。
2.转染T细胞株及融合基因表达检测
重组表达载体pLNCX/Igk-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)瞬时转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat,在转染24-48h后能够检测到融合蛋白的表达。转染后经G418筛选14d,转染细胞株Jurkat行PCR证实目的基因整合入细胞基因组,经流式细胞术检测显示有融合蛋白表达率达57.59％。
结论:
通过分子克隆、细胞转染等方法重新优化构建了含anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)融合基因的T细胞,融合基因能够在T细胞株表面表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。