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昆虫病原真菌是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一，具有直接穿透昆虫体壁而使其致病的独特机制。在穿透昆虫体壁的过程中，真菌会分泌一系列的水解酶，如几丁质酶和蛋白酶，降解寄主体壁，帮助菌丝穿透。结构分析表明，大多数几丁质酶具有多个结构域，包括催化域、铰链区和几丁质结合域。几丁质结合域能帮助几丁质酶结合到几丁质底物上，提高局部区域的酶浓度，从而促进对底物的降解。然而目前发现的来自昆虫病原真菌的几丁质酶缺乏几丁质结合域。本实验室的前期工作表明，在不具有几丁质结合域的昆虫病原真菌几丁质酶Bbchitl上添加家蚕几丁质酶的几丁质结合域，可以提高几丁质酶Bbchitl对不溶性底物的结合及降解能力。在球孢白僵菌中超量表达该融合蛋白，菌株的毒力得到显著提高。但是添加更多的几丁质结合域是否可以进一步增强几丁质酶与底物的结合能力，促进对底物的降解，从而进一步提高菌株的毒力呢?基于此设想，本文在前期工作的基础上构建了具有多个几丁质结合域的杂交几丁质酶，并进行了表达及特性分析。
获得的主要结果如下：
1．杂交几丁质酶毕赤酵母表达载体的构建在具有一个几丁质结合域的杂交几丁质酶Bbchitl-BmChBD(本实验室构建)基础上，构建了具有两个和三个几丁质结合域的杂交几丁质酶的酵母表达载体pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。
2．杂交几丁质酶的酵母表达及特性分析在毕赤酵母中表达并纯化了带有1、2和3个几丁质结合域的杂交几丁质酶Bbchitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>、Bbchitl-(BmChBD)<,3>和野生型几丁质酶Bbchitl。结合分析和酶学特性分析结果表明：1)在酶浓度为80μg/mL时，几丁质结合域的个数和杂交几丁质酶与粉末几丁质的结合存在剂量效应，即随着几丁质结合域数量的增加，杂交几丁质酶与粉末几丁质的结合能力增强。杂交几丁质酶Bbchitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(BmChBD)<,3>与粉末几丁质的结合率分别为 64.4％、67.4％和86.8％，明显高于野生型几丁质酶(4.3％)。而酶浓度为40μg/mL 时，杂交几丁质酶与粉末几丁质的结合无明显差异。2)添加几丁质结合域对几丁质酶的最适反应温度和最适反应pH无明显影响，野生型和杂交几丁质酶均在pH5.0和55℃的条件下具有最高的几丁质酶活性。虽然添加几丁质结合域提高了几丁质酶降解不溶性底物的能力，却降低了杂交酶的热稳定性。 3．杂交几丁质酶球孢白僵菌表达载体的构建为了进一步分析几丁质结合域对球孢白僵菌毒力的影响，构建了Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(BmChBD)<,3>的球孢白僵菌表达载体 puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。在下一步工作中，将进行相应的生测试验。
本论文研究表明添加2个和3个几丁质结合域BmChBD可以增加杂交几丁质酶对不溶性几丁质的结合与水解能力，但是对球孢白僵菌的毒力的影响需要进一步研究。