巨核细胞产生血小板是一个复杂的过程，受到多种细胞因子的调控，血小板生成素(TPO)就是其中之一。TPO通过与巨核细胞表面的受体MPL结合，引导信号传导通路，在体外刺激巨核细胞集落(CFU—MK)形成，在体内升高血小板的水平。但在巨核细胞成熟和血小板形成的过程中，TPO并不是必须的细胞因子。 此前，本实验室以Mp1胞外区为诱饵，利用酵母双杂交系统从人胎肝cDNA文库中筛选到—枚与TPO没有同源性的Mp1新配体，与人核迁移蛋白(hNUDC)序列相同。hNUDC是一种在多种细胞中与微管动力中心结合并且相互作用的多功能蛋白。经进一步的研究发现，hNUDC作为Mp1的一个新配体，在巨核系细胞的发育成熟和血小板的生成中也具有重要的作用，可以激发许多与TPO相同的生物反应。TPO主要作用于巨核细胞增殖成熟的阶段，而hNUDC主要作用于巨核细胞分化的晚期阶段和血小板的形成阶段。 为进一步研究hNUDC、TPO和Mp1的相互作用机理及hNUDC和TPO之间是否存在着相互影响的关系，在前期研究成果的基础上，本论文构建了下调hNUDC表达的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体，并在293T细胞中进行包装和初步的体外感染实验，获得了特异性高、感染效果好的慢病毒，可用于进一步的活性与功能研究。 慢病毒是逆转录病毒家族中的一员，可携带较大量的遗传信息，所以在将基因导入宿主细胞中时，慢病毒载体是常用的有效载体之一。而且至今为止，尚无一例关于慢病毒载体进入人体后发生逆转录的报道，因此其用于转导人体细胞时的安全性较高。 本论文以GeneBank中的hNUDC序列为准，根据shRNA的设计原则，利用在线软件设计了九对可以干扰hNUDC表达的短发夹RNA(shRNA)序列，经单链片段的合成和退火、克隆和测序，再与hNUDC一起构建到真核表达载体上，分别由不同的启动子启动表达。hNUDC与红色荧光蛋白基因(RFP)融合表达。在转染293T细胞后通过荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率及细胞的荧光强度，较快速地筛选到有效的干扰靶序列，并进一步通过WesternBlot和Real—timePCR验证。将得到的靶序列与报告基因一起克隆到慢病毒转移质粒pRRL—cPPT—CMV—X—PRE—SIN上，与包装质粒pMDL—G/P—RRE、包膜质粒pCMV—VSVG及REV表达质粒pRSV—REV共转染293T细胞，4天后离心收集上清。将上清再感染293T细胞，观察到荧光表达，说明获得了有感染能力的慢病毒。 总之，本论文运用了一种快速筛选有效RNA干扰靶序列的方法，筛选并构建了含有能下调hNUDC表达序列的慢病毒载体，并成功包装出慢病毒，为进一步研究hNUDC与TPO相互关系及其在巨核系细胞发育成熟和血小板生成过程中所起的作用提供了理论和实验的依据。