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目的:上世纪80年代,随着DNA重组技术的成熟,将其广泛应用于分子生物学和抗体基因结构的改造。抗体制备技术已从多克隆抗体、单克隆抗体发展到基因工程抗体。随着噬菌体展示技术、酵母展示技术等的出现大大提高了抗体的制备。基因工程抗体又经历了Fab抗体、sc Fv抗体、全人源抗体等,其具有穿透性强,分子量小,便于操作,不与Fc受体结合等特点,成为基因工程抗体研究热点。近年来,随着深入的研究,体外筛选技术成为筛选全人源抗体的主要方式。支气管哮喘是一种与遗传和环境密切相关的疾病,在过去几十年里,支气管哮喘发作在发达国家中逐年上升的趋势。相比之下,遗传因素一定在这样一个相对较短的时间不变。虽然数百研究员列出了几个潜在的遗传因素可能影响疾病易感性,但没有成功的尝试针对任何特定的基因因素来治疗支气管哮喘。根据哮喘的发病机制从基础分子免疫学、分子病理生理学的新发现去针对性的研制依从性较好、副作用少,可以改善患者病症的药物。无论是在小鼠和人上,细胞因子在哮喘的病理生理学非常重要,提出了一种抑制Th2等细胞因子如白介素(IL)-4,IL-5,和IL-13可能是一个合理的治疗哮喘方法。其中IL-13主要由CD4+Th2细胞和2型固有淋巴细胞(ILC2)分泌,IL-13诱导B淋巴细胞合成大量的Ig E抗体,同时增加嗜酸性粒细胞的募集,引起气道上皮细胞表达i NOS,黏液产生和杯状细胞增生,刺激气道平滑肌收缩,提高细胞外胶原蛋白和纤维母细胞向成肌纤维细胞表型转变等,IL-13通过IL-13Rα1与IL-4R形成受体复合物,参与信号转导,激活靶基因转录,诱导TH0细胞分化、气道炎症、气道高反应、黏液产生。因此,IL-13在哮喘气道炎症和重塑有显著的影响[1,2]。本实验将从前期构建的天然全人源抗体文库中筛选特异性好、有体外中和活性的抗IL-13单链抗体,为后期构建抗IL-4/IL-13双特异性抗体及研制治疗过敏性哮喘的抗体药物奠定基础。方法:构建IL-13 c DNA/p ET101/D-TOPO表达载体,转化到BL21表达菌体中,通过IPTG诱导表达蛋白,并进行纯化和鉴定。以生物素化IL-13蛋白为抗原,对前期构建的天然抗体文库利用噬菌体展示技术进行3轮富集,在富集的单链抗体文库中用ELISA筛选抗IL-13全人源单链抗体(sc Fv)。用Bst NI酶切方法对筛选抗IL-13-sc Fv阳性克隆子进行指纹图分析,将指纹图谱不同的克隆子送去测序。结果显示在单链抗体氨基酸序列中出现了琥珀终止密码子,位于第32位氨基酸处。将琥珀密码子进行校正,利用单点突变的方法突变终止密码子中的一对碱基后变为氨基酸Trp(W)。将校正后的基因双酶切后连接LZ16载体,转化大肠杆菌DH5a F,后进行表达纯化,用Dot Blot及Western Blot方法对表达纯化的抗IL-13-sc Fv蛋白进行鉴定;用竞争ELISA方法检测sc Fv和IL-13受体(IL-13Rα1)的竞争结合,分析sc Fv和IL-13受体(IL-13Rα1)是否作用于IL-13的同一抗原表位。从而达到封阻IL-13与受体结合的功能。用大分子相互作用分析技术对抗IL-13全人源单链抗体进行亲和力分析。结果:(1)IL-13抗原的表达纯化及鉴定:将扩增大小为700bp左右的c DNA与p ET101/D-TOPO连接,转化到表达菌株BL21进行包涵体表达,表达的蛋白分子量大小为29KDa左右,经Dot Blot及Western Blot鉴定表明有显色且条带唯一,则为IL-13抗原蛋白。(2)抗IL-13全人源单链抗体筛选与表达:以生物素化IL-13蛋白为抗原,对前期构建的天然抗体文库利用噬菌体展示技术进行3轮富集,通过ELISA检测有30%的sc Fv与IL-13有结合性;将得到的阳性克隆子与IL-4,TSLP通过ELISA检测特异性,结果显示有一些单克隆子与IL-4,TSLP不结合,即不显色,说明此单克隆子有较好的特异性,与其他细胞因子交叉反应较低。挑选14个OD值较高的抗IL-13-sc Fv阳性克隆子进行PCR扩增,用Bst NI酶切方法对其进行指纹图分析,将指纹图谱不同的克隆子送去测序。结果显示在单链抗体氨基酸序列中出现了琥珀终止密码子,位于第32位氨基酸处。对琥珀密码子进行校正,利用单点突变的方法突变终止密码子中的一对碱基后变为氨基酸Trp(W)。将校正后的基因双酶切后与原核分泌性表达载体LZ16连接,构建重组表达载体IL-13-sc Fv/LZ16,并转入大肠杆菌DH5αF,进行测序,测序正确后进行蛋白表达和纯化。对单链抗体进行表达及纯化,结果显示sc Fv在大肠杆菌DH5αF,中主要集中分泌在细胞周质间可溶性表达,抗体具备生物学活性,SDS-PAGE电泳显示纯化后的抗IL-13-sc Fv蛋白分子量大小为26KDa左右。(3)抗IL-13全人源单链抗体特性分析:Western Blot结果表明有显色,且条带唯一,即纯化得到的蛋白为抗IL-13-sc Fv。竞争ELISA结果显示:IL-13Rα1和筛选的单链抗体可竞争性的与IL-13结合,说明IL-13Rα1与单链抗体作用于IL-13的相同抗原表位,可有效的封阻IL-13/IL-13Rα1的信号通路具有生物学功能。大分子相互作用实验(Blitz)结果显示抗IL-13全人源单链抗体与相应抗原IL-13反应较好且得到亲和力KD值为10-7,可见筛选得到抗IL-13全人源单链抗体有较好亲和力;结论:成功筛选到具有体外中和活性、亲和力相对较高、特异性较好的抗IL-13单链抗体。