目的:当各级听中枢或听神经、螺旋器的毛细胞发生病变,导致对声音的感受与神经冲动的传导发生障碍,此即为感音神经性耳聋,是耳鼻喉科的临床常见病和多发病,内耳血流障碍是导致其发生的主要因素。越来越多的研究证实,缺血后的再灌注损伤会加重缺血导致内耳血流障碍。缺血再灌注损伤是一个复杂的病理和生理过程,是多个因素和靶点参与的反应。在近些年中医治疗内耳疾病的报道中,活血化瘀类药物最为常用和有效,其次是清肝泻火类药物,本实验中,将活血化瘀与清肝泻火联合用药结合形成泻火化瘀通窍法,以达到增加疗效的目的。本实验旨在探索(1)血管阻断法在大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型造模中的应用;(2)泻火化瘀通窍法对血管阻断法大鼠耳蜗缺血再灌注损伤的影响;(3)探明泻火化瘀通窍法改善耳蜗缺血再灌注损伤的分子作用机制。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法造模,造模成功后,将大鼠分为五组,每组12只,分别为正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组。实验方法:正常组:不给药;模型组:造模成功后,正常饮食不给药。清肝泻火组:造模成功后一天,每天分两次给予清肝泻火药物灌胃,每次2ml,每只大鼠均连续灌胃7天;行气活血化瘀组:造模成功后一天,每天分两次给予行气活血化瘀药物灌胃,每次2ml,含药物2g,每只大鼠均连续灌胃7天;泻火化瘀通窍组:造模成功后一天,每天分两次给予泻火化瘀通窍药物灌胃,每次2ml,共含药物5g,每只大鼠均连续灌胃7天。实验指标:(1)各组大鼠分别与造模后、用药前和用药后7天检测听觉脑干诱发电位ABR阈值;(2)用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;(3)TUNEL法检测细胞凋亡;(4)制备耳蜗组织匀浆,采用TBA法和可见光法对耳蜗组织的MDA含量和CAT活性进行检测;(5)荧光定量PCR技术检测Caspase-8、Caspase-3的mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(western blot)检测Caspase-8、Caspase-3的蛋白表达;(6)实时荧光定量PCR检测耳蜗组织中Fas、FasL mRNA水平变化;westernblot检测耳蜗组织中fas、fasl蛋白表达水平的变化;(7)梯度pcr检测耳蜗组织中xiap、xaf1mrna水平变化;westernblot检测耳蜗组织中xiap、xaf1蛋白表达水平的变化。统计学处理:采用spss18.0统计软件,计量数据以均数±标准差sx)(±表示,单因素方差分析(one-wayanova),组间比较采用最小显著差法(lsd)方法,以p<0.05和p<0.01作为显著性和极显著性差异的标准。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显著低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组(p<0.05-0.01)。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显著性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组外毛细胞分布呈三排,可清晰看到外毛细胞分布均匀,排列整齐,无明显缺失;模型组、清肝泻火组见外毛细胞大部分变形,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏,出现坏死和凋亡;行气活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,部分出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,个别轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡和坏死,泻火化瘀通窍组及行气活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,且行气活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤更为明显。3.正常组阳性细胞荧光基本分布在血管纹区域,基底膜上几乎无表达。模型组与药物干预组的基底膜上的三排外毛细胞荧光信号明显增多、增强,与正常组相比差异有统计学意义(p<0.01);而与模型组相比,泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组的毛细胞荧光信号明显减少(p<0.01),散在分布在基底膜上,且泻火化瘀通窍组这一表现更加明显(与行气活血化瘀组比较有统计学意义,p<0.05)。而清肝泻火组的毛细胞信号较泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组则明显增强(p<0.01)。4.耳蜗组织中丙二醛(mda)含量与cat活性测定结果显示:模型组和清肝泻火组的mda含量最高,显著高于其他各组(p<0.05),说明模型组和清肝泻火组两组大鼠的耳蜗微循环障碍最严重,泻火化瘀通窍组与清肝泻火组和模型组比较具有显著差异(p<0.05)。正常组的cat活性最高,显著高于其他组(p<0.05);泻火化瘀通窍组的cat活性显著高于行气活血化瘀组,差异具有统计学意义(p<0.05),与清肝泻火组及模型组相比较具有极显著差异(p<0.01)。5.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中caspase-8mrna和caspase-3mrna的表达量。结果显示与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3mrna的表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3mrna的表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组caspase-8、caspase-3蛋白表达,结果与mrna表达结果类似,与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3蛋白表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3蛋白表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中fasmrna和faslmrna的表达量,结果显示与正常组相比,模型组及清肝泻火组fas、faslmrna的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组与清肝泻火组相比,行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组fas、faslmrna的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组fas、fasl蛋白表达,泻火化瘀通窍组fas、fasl蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而行气活血化瘀组fas、fasl蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也又显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而清肝泻火组、模型组fas、fasl蛋白表达水平比正常组则明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。7.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中xiap、xaf1mrna的表达。正常组呈现较低表达,与其他各组相比有极显著差异(p<0.01);泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组xiapmrna表达水平较清肝泻火组、模型组明显增高(p<0.01);但是清肝泻火组和模型组两组xiapmrna表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组的xiap蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xiap蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显著增高(p<0.05,p<0.01);而行气活血化瘀组xiap蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也显著增高(p<0.05);但是清肝泻火组和模型组两组xiap蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组中xaf1mrna有表达,模型组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xaf1mrna表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01),;然而清肝泻火组与模型组两组xaf1mrna表达水平没有明显差异(p>0.05);行气活血化瘀组xaf1mrna表达水平也较正常组明显增高(p<0.01)。正常组的xaf1蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.05);泻火化瘀通窍组xaf1蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01);同样的,行气活血化瘀组xaf1蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也由明显降低(p<0.01);然而清肝泻火组与模型组两组xaf1l蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显著提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显著增加(p<0.05),7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.泻火化瘀通窍法可有效改善血管阻断法引起的大鼠耳蜗缺血再灌注损伤,降低mda含量,提高cat活力,且优于行气活血化瘀法。5.泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达,优于行气活血化瘀法。6.泻火化瘀通窍法可能通过抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达抑制毛细胞凋亡。7.fas和fasl基因和蛋白均参与大鼠耳蜗微循环障碍损伤,泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织fas和fasl的表达,且优于行气活血化瘀法。8大鼠耳蜗微循环障碍后耳蜗凋亡现象与XIAP及XAF1的表达相关,泻火化瘀通窍法可能通过提高XIAP的表达抑制XAF1的表达来抑制细胞凋亡的发生。9泻火化瘀通窍法抑制细胞凋亡能力高于活血化瘀法。