论文部分内容阅读
在与微生物长期共同进化过程中，植物形成了一系列的免疫反应抵御病原微生物的侵染。活性氧ROS(Reactive Oxygen Species)迸发是非常重要的免疫反应之一，它不仅可以通过自身的毒害作用抑制病原微生物生长，而且可以作为第二信使介导下游信号转导。脂多糖LPS(Lipopolysaccharide)，又称内毒素，是革兰氏阴性菌细胞外膜的糖脂复合物，它是一种重要的微生物相关分子模式MAMP(Microbe-associate Molecular Pattern)，可以诱导拟南芥产生双相ROS迸发。LPS及其活性成分lipidA诱导的早期ROS迸发和典型的MAMPs诱导的ROS迸发一样，短暂且快速，而后期缓慢且持久的ROS迸发是LPS所特有的。LPS引起的双相ROS迸发是一个全新的MAMPs引起的免疫反应，但双相ROS迸发的分子机制及其作用仍然未知。本研究通过遗传学筛选得到对LPS引起双相ROS迸发不敏感的拟南芥突变体delt1(Defective in LPS-triggered Late-ROS)，通过对delt1的详细研究解析了LPS调控双相ROS迸发的分子机制。获得的主要结果如下: (1)delt1-1和delt1-2为单基因隐性突变体。利用LPS诱导产生双相ROS迸发达一表型，我们筛选了LPS诱导ROS迸发不敏感突变体delt，其中两个在LPS处理后完全没有ROS迸发。正常生长条件下，植株与野生型相比无明显差异，与野生型回交F1代植株恢复了对LPS诱导的双相ROS迸发，回交F2代群体中LPS处理后有ROS迸发和无ROS迸发植株比例接近3∶1，这些结果表明它们为单基因隐性突变体。杂交互补实验证明它们是等位突变体，所以命名为delt1-1和delt1-2。 (2)DELT1编码RBOHD蛋白。通过图位克隆将DELT1基因初步定位到5号染色体18.32 Mb(Megabase pair)至22.19 Mb之间的3.87 Mb区段;通过基因组重测序(MutMap)将DELT1基因缩小到5号染色体19.05 Mb至21.10 Mb之间的2.05 Mb区段。对该区段里的6个突变基因进行分析，推测RBOHD为候选基因。 deltl-1、delt1-2与rbohD缺失突变体等位分析验证了delt1-1与delt1-2的ROS缺失是由于RBOHD突变导致的。在delt1-1突变体中，RBOHD基因核苷酸序列的第830位碱基由G突变为A，导致RBOHD翻译提前终止。在delt1-2突变体中，RBOHD核苷酸序列第4173位碱基由G突变为A，导致第919位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)。 (3)E919突变影响RBOHD蛋白的活性。为了明确RBOHD的919位谷氨酸(E919)的功能，我们首先分析了delt1-2突变体中RBOHD基因的转录水平以及E919突变对RBOHD的亚细胞定位、蛋白互作和内源蛋白积累量的影响。结果发现，delt1-2突变体中RBOHD的转录水平与野生型相比没有显著差异，E919突变对RBOHD蛋白的亚细胞定位和内源蛋白的积累没有影响，对RBOHD蛋白自身互作以及与胞内受体激酶B1K1(Botrytis-induced Kinase1)蛋白的互作没有影响。然后，我们分析了E919突变对于RBOHD蛋白活性的影响，结果发现，相比于野生型，rbohD和delt1-2突变体中NADPH氧化酶的活性显著降低，说明E919突变影响了RBOHD蛋白的活性。 (4)RBOHD的E919突变影响lipidA诱导的气孔关闭。我们发现lipidA可以诱导拟南芥气孔关闭，但在rbohD和delt1-2突变体中，lipidA不能诱导气孔关闭，说明RBOHD介导的ROS在lipidA诱导气孔关闭中起着非常重要的作用，且E919突变使RBOHD丧失这一功能。 综上，本研究发现NADPH氧化酶RBOHD介导了LPS诱导的双相ROS迸发，delt1-2突变体中，RBOHD蛋白的919位谷氨酸(E919)突变，导致RBOHD蛋白活性显著降低，flg22和lipidA处理后ROS迸发减弱，从而影响气孔关闭。LPS诱导的活性氧抗性是非常保守的反应，这为农业生产上创制广谱抗病品种提供了理论依据。